白雅琴 ，刘艳文 ，赵名扬 ，秦红林 ，王成强 ，潘和平

（1.甘肃省畜牧业产业管理局，兰州 730030；2.西北民族大学，兰州 730030）

甘肃省岷县黑裘皮羊为著名地方优良绵羊品种，又称岷县黑紫羔羊，属山谷型藏羊，是优秀的裘用羊种之一，同时也为人们提供优质的肉、乳、毛等产品。岷县黑裘皮羊产地海拔一般为2 500～3 200 m，主要分布在甘肃武都地区的西北部，洮河中游，是甘肃甘南高原与陇南山地接壤区主要绵羊品种之一。该羊体质细致，结构紧凑。头清秀，鼻梁隆起，公羊有角，向后向外呈螺旋状弯曲，母羊多数无角，少数有小角；颈长适中，背平直，尾小呈锥形。体躯、四肢、头、尾和蹄全呈黑色。

肌肉生长抑制素（Myostatin，MSTN）是1997年发现的一类在骨骼肌中广泛表达的糖蛋白，其编码蛋白质是转化生长因子-β（TGF-β）的一员，可阻碍肌细胞和肌纤维的生长。MSTN基因的缺失或降低会引起动物机体的肌肉过度发育［1］。作为一个骨骼肌生长负调节因子，MSTN还可能会影响瘦素的产生、分泌［2］，调控脂肪细胞分化［3］。Kambadur等研究发现，在相同饲养管理条件下，MSTN基因突变的双肌牛比普通牛的产肉量明显增加［4］。其他的研究也观察到，MSTN 基因突变也会造成人［5］、狗［6］、猪［7］、羊［8-10］等呈现双肌表型。为了深入探讨岷县黑裘皮羊MSTN基因的理化性质和生物学功能，本研究利用克隆、测序技术和生物信息学方法，对岷县黑裘皮羊MSTN基因第一外显子的相关生物信息学特征进行了预测和分析，同时构建了系统发育进化树，为揭示该基因理化性质、功能信息及相关生理机制提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 样品采集

24份血样，采自生长环境一致、健康状况良好的岷县黑裘皮羊（雌雄各半）。采用医用采血管，自尾静脉采血10 mL，-20℃保存备用。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与PCR扩增 采用苯酚-氯仿抽提法［11］从冻存血样中提取岷县黑裘皮羊总基因组DNA，加去离子水溶解稀释，-20℃保存备用。

依据GenBank中收录的绵羊MSTN基因序列（NM_001009428），应用Primer 5.0软件设计引物对P1，交兰州领先生物技术有限公司合成。上游引物序列为：5′-CGTTTGGCTTGGCGTTACTC-3′，下游引物序列为：5′-GAAGATCAGACTCCGTGGGC-3′；预计扩增产物大小为468 bp。PCR扩增体系总体积为20 μL：DNA模板0.5μL，上下游引物各 0.3μL，2×TaqPCRMasterMix10μL，无菌水 8.9 μL。PCR 扩增程序：95℃预变性 5 min，94℃变性 30 s，51.4℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，30 个循环；72℃延伸3 min，4℃保存。PCR产物用T载体克隆，经上海生工生物工程技术服务有限公司测序后，得到其目的片段基因序列。

1.2.2 岷县黑裘皮羊MSTN基因P1引物扩增结果 岷县黑裘皮羊MSTN基因PCR扩增结果如图1所示，可见扩增产物电泳条带清晰，片段大小与预期扩增片段相符。

图1 岷县黑裘皮羊MSTN基因P1引物的琼脂糖检测

1.3 生物信息学预测和分析

对岷县黑裘皮羊MSTN基因第一外显子编码产物的氨基酸序列、蛋白质特性及功能结构进行分析与预测所用各种网址与工具软件见表1。

表1 岷县黑裘皮羊MSTN基因第一外显子生物信息学主要分析软件[12]

2 结果与分析

2.1 编码氨基酸理化性质的预测和分析

蛋白质一级结构氨基酸脱水缩合形成的多肽链，其基本性质包括氨基酸组成、相对分子质量、半衰期等。利用在线软件http：//web.expasy.org/protparam/进行分析，结果见表2。岷县黑裘皮羊MSTN基因第一外显子编码69个氨基酸，20种氨基酸所占比例见表3，其中亮氨酸（Leu）数目最多，占整个氨基酸组成的13.0%，不存在色氨酸（Trp），编码产物不稳定系数大于40，表明该基因编码产物不稳定［13］。

2.2 编码蛋白质疏水性/亲水性预测与分析

利用在线软件 http：//web.expasy.org/protscale/对岷县黑裘皮羊MSTN基因第一外显子编码氨基酸序列亲水性/疏水性进行分析和预测，结果如图2所示。其中第31位异亮氨酸（Ile）的疏水性最强（+4.500）；第50位的精氨酸（Arg）的亲水性最强（-4.500）。整条氨基酸肽链中，亲水氨基酸占65.00%，疏水氨基酸占35.00%，总平均亲水性为-0.49，表现为亲水性，因此，可推断岷县黑裘皮羊MSTN基因第一外显子编码的蛋白质是一种可溶性蛋白。

2.3 编码蛋白质N-糖基化位点预测和分析

蛋白质糖基化是真核生物蛋白质翻译后加工的重要修饰之一，蛋白质糖基化修饰对蛋白质折叠、分选及其定位有重要影响，使用在线软件http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/对MSTN基因特定片段N-糖基化位点进行预测，结果如图3所示。岷县黑裘皮羊MSTN基因第一外显子编码氨基酸不存在N-糖基化位点。

表2 岷县黑裘皮羊MSTN基因第一外显子编码蛋白质理化特征

表3 岷县黑裘皮羊MSTN第一外显子编码蛋白的氨基酸组成%

2.4 编码蛋白质的二级结构和全蛋白质三级结构预测与分析

蛋白质的二级结构是指依靠不同氨基酸之间的C=OH和N-H基团间的氢键形成的稳定结构（主要为α-螺旋和β-折叠），蛋白质多肽链在各种二级结构的基础上再进一步盘区或折叠，形成具有一定规律的三维结构，即三级结构。岷县黑裘皮羊MSTN基因第一外显子编码蛋白质二级结构的预测结果（图4）显示，α-螺旋（Hh）占36.23%，β-折叠（Ee）占 18.84%，β-转角（Tt）占8.70%，无规则卷曲（Cc）占36.32%。肌肉生长抑制素二级结构中，Cc占主导地位。绵羊MSTN基因编码蛋白质的三级结构见图5，从预测结果来看，其三级结构主要成分为无规则卷曲（Cc），与岷县黑裘皮羊MSTN基因第一外显子编码产物二级结构的预测结果一致。

图2 岷县黑裘皮羊MSTN基因第一外显子编码蛋白质的疏水性预测结果

图3 岷县黑裘皮羊MSTN基因第一外显子编码蛋白质N-糖基位点预测

图4 岷县黑裘皮羊MSTN基因第一外显子编码蛋白质二级结构预测

2.5 编码蛋白质信号肽分析

信号肽位于蛋白质N-端，一般由16～26个氨基酸残基组成［14］，是决定新生肽链在细胞中的定位或决定某些氨基酸残基修饰的一些肽段。信号肽可使正在翻译的核糖体附着到RER膜上，并指引蛋白质在细胞内的运输。在线软件 http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/分析结果显示（图6），岷县黑裘皮羊MSTN基因第一外显子编码产物C值0.170，Y值0.225，S值0.339，其切割点最有可能位于39～40位的氨基酸间，基本可以判定岷县黑裘皮羊MSTN基因第一外显子编码产物存在信号肽。

图6 岷县黑裘皮羊MSTN基因第一外显子编码蛋白质信号肽分析

2.6 绵羊MSTN基因编码蛋白的同源序列分析

对9个物种的MSTN基因编码产物序列进行同源性分析，并构建系统进化树（图7）。由分析结果可知，MSTN基因几乎在所有的哺乳动物中都有表达。从进化树分析结果来看，进化树分为两大支，其中斑马鱼为独立的一支。从另一支中可以发现，绵羊MSTN基因的亲缘关系与牛最近，分子进化距离最近。

图7 绵羊MSTN基因编码蛋白质的氨基酸系统进化树

3 讨论

许多研究表明，MSTN基因编码的肌肉生长抑制素能调控骨骼肌的发育，其活性的丧失或降低，会引起动物肌肉的过度发育，肉质下降，出现双肌性状。比利时蓝白花奶牛中MSTN基因缺失某些片段，导致该基因阅读框架发生改变，分子活性区域消失，出现双肌比利时牛；皮埃蒙特牛的MSTN基因外显子1中某位点C变成A，外显子3中某位点G变成A，从而导致双肌牛［15］。因此，对MSTN基因第一外显子的生物信息学分析可间接对畜禽生产实际及经济价值利用有一定的指导作用。

蛋白质结构决定其功能特点，进而影响其生命活动的代谢。岷县黑裘皮羊MSTN基因第一外显子编码69个氨基酸，编码产物为不稳定的可溶性蛋白质。研究表明，蛋白质半衰期与蛋白质的稳定性成正比［16］。而本研究发现，MSTN基因第一外显子编码产物氨基酸具有较长的半衰期（20 h）却是不稳定蛋白，出现这一特性的原因可能与其不同生理功能的发挥存在某种联系，即可能是岷县黑裘皮羊的整个CDS区序列编码产物也具有相同的特性。N-糖基化是真核生物蛋白质翻译后重要的修饰之一，N-糖基化主要包括N-糖的合成、转移和修饰3个过程。N-糖的合成和转移在内质网中进行，其修饰过程在内质网和高尔基体中都存在。它可以影响蛋白质的抗原决定簇、电荷性质、热稳定性、最终产物的结构和功能，从而产生不同的表达效果，还可以调控蛋白质在组织和细胞中的定位、功能和活性［17］，糖基化位点发生变化可能与疾病的发生有关［18］。而本研究中岷县黑裘皮羊MSTN基因第一外显子编码蛋白上不存在糖基化位点，在此结果上就可以进一步推断岷县黑裘皮羊MSTN基因CDS区序列编码蛋白是否存在糖基化位点。据相关报道，无规则卷曲易受侧链相互影响而改变空间构象，α-螺旋和无规则卷曲是蛋白质多肽链中构成配体受体结合的活性部位［19］，MSTM基因第一外显子编码蛋白质二级结构中大量的无规则卷曲可能影响蛋白质多肽链的结合活性，从而影响蛋白质的功能。而肌肉生长抑制素很可能是通过自分泌机制调控肌肉生长性分化［20］，进而抑制肌肉细胞前体增殖而发挥其功能［21］。这说明肌肉生长抑制素的作用机制与其蛋白质二级结构存在着紧密的关系。另外，绵羊MSTN基因编码产物的三级结构预测结果和岷县黑裘皮羊MSTN基因第一外显子编码产物相似，均是以无规则卷曲为主，表明岷县黑裘皮羊MSTN基因CDS区编码产物的二级结构和三级结构应该也都是以无规则卷曲为主。从氨基酸系统进化树可以看出，绵羊MSTN基因氨基酸序列与牛的同源性最高，其次为家马，由此可推测，相对于其他动物，岷县黑裘皮羊（绵羊）MSTN基因氨基酸序列和牛的同源性更高的概率较大。