罗惠娣，毛杨毅，郭慧慧，张 丽，王志武，王志俊，李 俊，郭宏宇，薛丽娜，党文庆

（山西省农业科学院畜牧兽医研究所，太原 030032）

随着社会经济的发展和人民生活水平的提高，市场上对优质羊肉需求量日益增加，对优种肉羊需求量也越来越多。因此，优种肉羊快速繁殖技术也成为当前肉羊研究的热点之一。在20世纪末和21世纪初，科学家们对优种肉羊胚胎移植技术进行了深入研究，成倍增加了优种肉羊数量。但传统超数排卵和胚胎移植（Multiple ovulation and embryo transfer，MOET）技术仅用于成年羊，超数排卵只均可获得8～10枚胚胎，世代间隔长，繁殖速度仍较慢。

澳大利亚南澳政府生殖与发育研究中心（South Australia Reproduction Institute，SARD） 研究与开发的“JIVET”技术（Juvenile in vitro embryo technology），是集幼畜的超数排卵与采卵、卵母细胞体外成熟与受精、受精卵体外培养与移植等技术为一体的新的快速繁殖技术体系。其原理是1～2月龄羔羊卵巢上有腔卵泡数量达到高峰，卵泡发育很少发生闭锁，卵巢对生殖激素非常敏感。但由于羔羊脑垂体机能尚未健全，不能分泌足够量的促性腺激素刺激卵巢活动，卵泡最终不能发育成熟而排卵。如果此阶段利用外援促性腺激素诱导技术，平均每只羔羊可获得卵母细胞80～160枚，是成年羊超数排卵获得卵子的10倍左右，且世代间隔仅为成年羊的1/3时间，大大加快了优种羊的繁殖速度。目前，国外科学家对优种羊JIVET技术研究的较深，并取得了可喜成果［1-5］；国内科学家安晓荣、汪立芹、郭洪、刘宗正、马世科、陈晓勇等也分别对新疆自治区、辽宁省、山东省、青海省及河北省饲养的萨福克羊、哈萨克羊、辽宁绒山羊和小尾寒羊等进行了JIVET技术研究［6-16］。但迄今为止，未见山西省有关优种羊JIVET技术研究的报道，为此山西省农业科学院畜牧兽医研究所联合中国农业大学进行幼龄杜泊羊胚胎体外生产技术的研究，以优化优种羊JIVET技术体系。

1 材料与方法

1.1 试验时间与地点

2014年5月5—23日在山西省农业科学院畜牧兽医研究所动物遗传工程实验室进行卵母细胞体外成熟和受精试验，在晋中林山合作社羊场进行体外受精卵移植试验。

1.2 材料

1.2.1 试验羊 杜泊公羊、4～8周龄杜泊羊和受体羊由晋中林山合作社羊场提供。

1.2.2 冻精和发情羊血清 杜泊羊冷冻精液和发情羊血清（ESS）由山西省农业科学院畜牧兽医研究所动物遗传工程实验室自制。

1.2.3 主要激素、试剂及耗材 羊栓（CIDR）、促卵泡素（FSH）、促黄体素（LH）、孕马血清（PMSG）和 17β-雌二醇（17β-E2）均购自北京绿欣农牧科技有限公司。M199、肝素钠、牛血清白蛋白（BSA）、必需氨基酸（EAA）、非必需氨基酸（NEAA）等生物试剂和 CaCI2·2H2O、NaHCO3、KH2PO4等化学试剂均购自山西赛奥生物科技有限公司。四孔培养板购自Nunc公司，园底试管、离心管、培养皿等均购自Corning公司。

1.2.4 主要仪器 体视显微系统（OLYMPUS SZX10）、倒置显微系统（OLYMPUS IX71）、超净工作台（SW-CJ-2FD）和二氧化碳培养箱等（SANYO MCO-5AC）均由山西省农业科学院畜牧兽医研究所提供。

1.2.5 培养液 采卵液：M199（含20 mmol/L Hepes，2%ESS，10 mg/mL 肝素钠）；成熟液：M199（含 20%ESS，10 μg/mL FSH，10 μg/mL LH，1 μg/mL 17β-E2）；获能液：合成输卵管液（SOF）（含 20 μg/mL 肝素钠）；受精液：SOF液（含 2%ESS）；受精卵发育液：SOF液（含 8 mg/mL BSA，2%EAA，1%NEAA）。

1.3 方法

1.3.1 冻精制作 将活力0.8以上的杜泊羊精液用常规干冰冷冻法制作颗粒冻精。

1.3.2 ESS制备 从发情羊的颈静脉采集血液，4℃冰箱静置20 h左右，吸取血清，56℃水浴灭活30 min，用0.22 μm滤器过滤后分装，-20℃冷冻保存。

1.3.3 羔羊超数排卵 采用Kelly等［1］羔羊超数排卵方法，不同的是PMSG注射量每只320 U。

1.3.4 精子获能 采用白佳桦［6］精子体外获能方法。

1.3.5 采集卵母细胞 供体羔羊经麻醉、固定、手术部位消毒后，用手术刀在乳房前腹部稍偏正中线处切3～5 cm小口，轻轻将卵巢牵到腹腔外，用吸有2 mL采卵液的10 mL注射器上的18＃针头刺破卵巢上直径2 mm以上的卵泡，吸出卵丘-卵母细胞复合体（COCs），采卵完毕，术口缝合与消毒。

1.3.6 卵母细胞成熟-受精-受精卵培养 将采集到的A、B级COCs放入四孔培养板孔中的成熟液里，矿物油覆盖，在5%二氧化碳培养箱中（38.5℃、饱和湿度）成熟培养24 h左右，以第一极体排出为卵母细胞成熟的评判标准。

将成熟的卵母细胞在0.2%透明质酸酶的溶液中轻轻吹打除去部分卵丘细胞后，放入四孔培养板孔中的受精液里，加入获能精子，浓度为每毫升 1×106～2×106个精子，覆盖矿物油，在5%CO2培养箱中受精孵育24 h。

除去受精卵上附着的残留精子和卵丘细胞后，放入四孔培养板孔中的受精卵发育液里，覆盖矿物油。再将四孔板装入铝箔袋内（充入5%CO2、7%氧气、88%氮气的混合气体），封口。在5%二氧化碳培养箱中培养24 h左右，显微镜下观察卵裂情况并统计卵裂率。

1.3.7 受体羊同期发情 受体羊阴道埋植CIDR 12 d，在撤出CIDR时每只受体羊肌肉注射PMSG 330 U。

1.3.8 受精卵移植 手术方法同前1.3.5，轻轻将卵巢有排卵点一侧的卵巢和输卵管牵到腹腔外，用移胚器吸4～5枚2～4细胞期受精卵植入输卵管壶腹部。

1.4 数据处理方法

试验数据采用Excel统计分析。

2 结果与分析

2.1 促性腺激素诱导的效果

4～8周龄杜泊羊采集卵母细胞情况见表1，卵巢和卵泡发育情况见图1。

由表1可知，促性腺激素诱导的8只4～8周龄杜泊羊，其中7只羊卵巢发育，超排反应率87.50%。共获得卵母细胞复合体（COCs）605 枚，平均 75.63 枚/只；A、B级卵母细胞复合体（COCs）585枚，平均73.13枚/只。

由图1可知，对激素诱导有反应的7只4～8周龄杜泊羊，卵巢体积增大、红涨，上面布满了发育卵泡。

表1 4～8周龄杜泊羊采集卵母细胞情况 枚/只

图1 促性腺激素诱导后卵巢上卵泡

2.2 卵母细胞体外发育情况

将585枚可用卵母细胞（COCs）通过在体外成熟液里成熟培养，其中有439枚卵母细胞成熟，成熟率75.04%；将成熟卵母细胞与获能精子共同孵育、受精卵培养后，有346枚受精卵分裂为2～4细胞，卵裂率59.15%，平均获得2～4细胞期体外受精卵43.25枚/只。受精卵发育情况见图2。

图2 2～4细胞期体外受精卵

2.3 2～4细胞期受精卵移植的效果

将77枚2～4细胞期的体外受精卵移植于17只同期发情受体母羊的输卵管壶腹部，每只母羊移植4～5枚受精卵。结果7只母羊怀孕，产羔13只，其中6只母羊产双羔，1只母羊产单羔，受胎率41.18%，平均6枚2～4细胞期体外受精卵可生产1只JIVET（试管）羔羊，“试管羊”见图3。

图3 移植2～8细胞期体外受精卵生产的“试管羊”

3 讨论

3.1 激素诱导方法对幼龄杜泊羊胚胎体外生产技术体系的影响

用促性腺激素诱导幼龄杜泊羊卵巢上卵泡发育，并获得大量的卵母细胞是建立幼龄杜泊羊胚胎体外生产技术体系的基础。在激素诱导幼龄羊的研究领域，Gou等［5］用FSH和PMSG诱导1月龄羔羊，获得卵母细胞79.1 枚/只；Kelly 等［1，3］对每只 1～2 月龄羔羊注射 FSH 160 mg和PMSG 500 U进行了卵泡发育的研究，结果每只羔羊获得卵母细胞80.0枚以上；武伟伟等［17］采用等量法和递减法对每只30～60 d的新疆细毛羊羔羊注射120 U的FSH进行卵泡发育研究，结果表明，等量法获得卵母细胞101.0枚/只，显著高于递减法（39.0枚/只）；于勇等［18］为研究1月龄和3月龄陶寒杂种羊的卵泡发育，采用2天4次等量法对每只羊注射FSH 160 mg，最后一次注射FSH时加注PMSG 500 U，结果表明，1月龄羔羊血液中FSH水平显著高于3月龄羔羊，获得卵母细胞79.0枚/只，显著高于3月龄羔羊（18.5枚/只）。本试验采用加拿大生产的FSH和宁波激素厂生产的PMSG诱导4～8周龄杜泊羊卵巢上的卵泡发育，2天4次（只均每次40 mg）间隔12 h注射FSH，最后一次注射FSH的同时每只羊注射PMSG 320 U，平均获得卵母细胞复合体（COCs）75.63 枚/只。本研究结果与 Gou 等［5］、Kelly等［1，3］研究的 1～2 月龄羔羊结果基本一致，也与武伟伟等［17］、于勇等［18］采用的等量激素诱导法诱导 1 月龄陶寒杂种羊和30～60 d新疆细毛羊羔羊卵泡发育的研究结果一致。说明本试验采用促性腺激素诱导4～8周龄杜泊羊的卵巢卵泡发育的方法可行。

3.2 卵母细胞体外成熟-受精-受精卵培养的方法对幼龄杜泊羊胚胎体外生产技术体系的影响

幼龄羊卵母细胞体外成熟、受精孵育、受精卵培养等方法构成幼龄羊胚胎体外生产的培养体系，任何一个环节出现问题都会影响幼龄羊胚胎体外生产的效果。在卵母细胞体外培养体系研究中，Bai等［4］在蒙古羔羊卵母细胞成熟液里添加600 μmol/L半胱氨酸和100 μmol/L β-巯基乙醇，受精率和囊胚率分别达86.9%和23.9%，显著高于对照组的67.9%和14.9%（P＜0.05）；研究还发现，在成熟液里添加半胱氨酸和β-巯基乙醇，可以降低卵母细胞孤雌激活和多精子受精比例，加快受精卵发育到囊胚的速度。郭洪等［19］在4～8周龄绵羊卵母细胞体外成熟液里添加100 μmol/L β-巯基乙醇，结果表明，卵裂率（68.0%）高于对照组（64.2%），且囊胚率（19.3%）也显著高于对照组（9.8%）（P＜0.05），表明 β-巯基乙醇能显著提高羔羊卵母细胞的发育能力。汪立芹等［7］进行了萨福克羔羊卵母细胞体外发育的研究，结果表明，卵裂率73.93%。常迪等［20］进行了波尔山羊羔羊体外受精技术研究，发现CIDR+FSH组合超数排卵获得卵母细胞卵裂效果好，卵裂率69.0%。本试验采用常规卵母细胞体外受精培养体系和培养方法进行4～8周龄杜泊羊卵母细胞发育研究，成熟率75.04%，卵裂率59.15%，卵裂率稍低于 Bai等［4］、郭洪等［19］、汪立芹等［7］及常迪等［20］对幼龄蒙古羊、4～8周龄绵羊、幼龄萨福克羊及波尔山羊羔羊的研究结果。其原因可能是二氧化碳气体纯度影响了卵母细胞发育，使卵母细胞的成熟和卵裂有点滞后，导致卵母细胞成熟率及受精卵的卵裂率有所降低。

研究表明，本试验采用的4～8周龄杜泊羊胚胎体外生产的培养方法可行，但仍需要进一步改进和提高。

3.3 2～4细胞期受精卵移植方法对幼龄杜泊羊胚胎体外生产技术体系的影响

羊卵子受精在输卵管壶腹部，受精卵发育到16细胞期是在输卵管完成的。因此，2～4细胞期体外受精卵移植应在输卵管移植。汪立芹等［7］、郭洪等［8］、刘宗正等［9］、马世科等［10］进行了萨福克羊、哈萨克羊、陶赛特羊及小尾寒羊的JIVET技术研究，受胎率16.6%～53.6%。本试验将2～4细胞期的体外受精卵移植于同期发情受体母羊的输卵管壶腹部，受胎率41.18%，与上述研究者的研究结果相一致。表明本试验采用的2～4细胞期受精卵移植方法可行。

4 结论

本试验进行4～8周龄杜泊羊胚胎体外生产技术的研究，平均获得A、B级卵母细胞73.13枚/只，2～4细胞期体外受精卵43.25枚/只，卵裂率59.15%，给17只受体母羊移植77枚2～4细胞期体外受精卵，7只受孕，生产13只“试管羊”，受胎率41.18%。结果表明，本试验采用的激素诱导技术、卵母细胞体外成熟-受精-受精卵培养技术及2～4细胞期受精卵移植技术，可作为4～8周龄肉用绵羊胚胎体外生产的有效技术。

致谢：感谢国家绒毛用羊技术体系胚胎工程岗位专家安晓荣教授及团队成员侯健、关宏、阎凤祥、郑立和王春昕等对本文试验的支持。