张曦 ，黄选章 ，曾云云 ，张为民 *

（1.温州医科大学附属第二医院，浙江 温州 325000；2.广州军区广州总医院，广东 广州510010）

肺癌已经进入分子靶向治疗的时代，以吉非替尼、厄洛替尼为代表的表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂 （epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors，EGFR-TKIs）被广泛应用于晚期非小细胞肺癌的各线治疗，然而耐药现象的出现成为制约靶向治疗进一步应用的瓶颈[1-2]。因此，发现非小细胞肺癌对EGFR-TKIs的获得性耐药机制、寻找逆转耐药的新途径具有重要的临床意义。既往研究发现，胰岛素样生长因子I型受体（insulin-like growth factor-1 receptor，IGF-1R）参与介导非小细胞肺癌EGFR-TKIs的获得性耐药[3-4]，但抑制IGF-1R表达是否能逆转肺癌细胞对EGFR-TKIs的获得性耐药未见报道。因此，本研究拟通过RNAi技术，观察抑制IGF-1R表达对非小细胞肺癌细胞EGFR-TKIs的敏感性及IGF-1R下游相关信号通路的影响，以探讨靶向抑制IGF-1R对逆转非小细胞肺癌EGFR-TKIs获得性耐药的影响及其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 材料 非小细胞肺癌EGFR-TKIs耐药细胞株H460/ER由课题组前期培养所得；三质粒慢病毒载体系统购自吉凯基因公司；DMSO、MTT购自Sigma公司；1640培养基购自Gibco公司；限制性内切酶、T4DNA ligase M0202v、T4DNA ligase buffer购自NEB公司；Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司；Trizol购自 Invitrogen公司；QIAGEN Plasmid大抽Kit购自QIAGEN公司；PCR引物由上海吉凯基因公司合成 （IGF-1R上游引物：5’-TGCGTGAGAGGATTGAGTTTC-3’，下游引物：5’-CTTATTGGCGTTGAGGTATGC-3’；内参GAPDH上游引物：5’-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3’，下游引物：5’ -CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3’；qRT-PCR试剂盒购自罗氏公司；EGFR、IGF-1R、ERK、AKT、p-IGF-1R、p-EGFR、p-AKT、p-ERK、β-actin 等蛋白一抗和二抗均由Cell Signaling公司提供；24孔Transwell板购自Corning公司。

1.2 siIGF-1R重组慢病毒载体的构建及病毒包装

1.2.1 慢病毒载体的构建 按照GeneBank提供的IGF-1R基因编码区，设计3对相应shRNA序列，通过BLAST分析及前期预实验，确定干扰靶序列“GCTTCACCGTTTACTACAA”，委托上海吉凯公司合成干扰序列的双链DNA oligo。……