吴 靖，续 蕾

0 引言

五味子乙素(Schisandrin B)是一种来源于中草药五味子的活性物质，属于脂素类物质。前期研究发现，五味子乙素具有广泛的药理活性，其中以抗炎效果较为显著[1-3]。研究还证实，五味子乙素对短暂性局部脑缺血大鼠的神经细胞具有保护作用[4]，能改善中枢神经系统的功能。Traf6/TAK1信号通路的活化在炎症反应中起着重要的作用。Traf6作为一种衔接蛋白可以介导LTR4信号的传导，最终激活NF-κB信号通路，诱导炎症的发生[5-6]。为了探讨五味子乙素对神经细胞的炎症反应是否具有保护作用，本文以LPS作用小神经胶质细胞BV-2诱导神经炎症损伤模型，通过观察细胞增殖抑制率、炎症因子及炎症相关蛋白的表达，探究五味子乙素对BV-2细胞炎症损伤的保护效应及其作用机制。

1 材料及方法

1.1 材料 小神经胶质BV-2细胞购买于武汉巴菲尔生物科技有限公司；五味子乙素(北京博奥森生物科技有限公司，纯度98%，批号：61281-37-6)；脂多糖LPS(美国Sigma公司，批号：A0267975)；CCK8试剂盒(北京普利莱基因技术有限公司，批号：59-20061)；ELISA试剂盒(深圳宝安康生物科技有限公司，批号：HSP-70)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(长沙赢润生物科技有限公司，批号：P0006)；SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(沈阳万类生物科技有限公司，批号：P0012A)；RPMI 1640培养基(Gibco公司，批号：HS30809)；β-actin、iNOS、COX-2、Traf6、TAK1及p-TAK1一抗均购自英国Abcam公司；对应二抗购自上海谷歌生物有限公司。

1.2 仪器 酶标仪(美国宝特公司，型号：ELX808IU)；单人超净台(广州泸瑞明仪器有限公司，型号：SW-CJ-1C)；细胞培养箱(美国Thermo公司，型号：HERAcell 2401)；双色红外激光成像系统(美国BIO-RAD，批号：LI-COR ODYSSEY)。

1.3 BV-2细胞培养 将单人超净工作台及相关实验物品紫外光照30 min，复苏BV-2细胞进行传代培养，细胞用1640完全培养基(10%胎牛血清，1%的100 U/ml青霉素及100 mg/ml链霉素)于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，每隔2 d换液1次，培养3～4 d后进行传代培养，并在倒置显微镜下观察细胞形态，取对数生长期细胞进行后续实验。

1.4 细胞增殖实验 取对数期细胞进行消化、离心、重悬、计数后，取适量细胞接种于96孔板中，培养过夜，分为空白对照组(C组)、LPS诱导模型组(M组)、LPS+10 μmol/L五味子乙素组(SL组)、LPS+20 μmol/L五味子乙素组(SM组)、LPS+40 μmol/L五味子乙素组(SH组)，培养24 h后吸净旧培养基，每孔加入100 μl含10 μl CCK9试剂的完全培养基，继续于37 ℃、5% CO2培养箱中孵育1 h，然后在波长450 nm处的酶标仪中测定每孔吸光度值。

1.5 细胞上清IL-6、TNF-α水平检测 取对数期细胞进行消化、离心、重悬、计数后，取适量细胞接种于6孔板中，培养过夜，细胞分组、培养按“1.4”项下操作，收集细胞上清，按照ELISA试剂盒操作说明书进行IL-6、TNF-α水平检测。

1.6 免疫印迹检测蛋白水平 取对数期细胞进行消化、离心、重悬、计数后，取适量细胞接种于6孔板中，培养过夜，细胞分组、培养按“1.4”项下操作，收集细胞，裂解，离心，收集上清，检测蛋白浓度。然后每孔上样50 μg，进行电泳分析，转膜，封闭，孵育一抗过夜，洗膜，孵育二抗，洗膜及蛋白表达分析。

2 结果

2.1 五味子乙素对BV-2细胞增殖的作用 由图1可见，LPS能明显抑制BV-2细胞增殖，降低细胞相对存活率，与C组比较差异有统计学意义(P<0.05)。在经过不同剂量的五味子乙素(10、20、40 μmol/L)干预后，BV-2细胞的相对存活率明显升高，与M组比较差异有统计学意义(P<0.05),并且随着药物剂量的增加，BV-2细胞相对存活率升高，见图1。

图1 五味子乙素对BV-2细胞增殖的影响(n=6)

注：*与C组比较，P<0.05；#与M组比较，P<0.05；△与SL组比较，P<0.05；▲与SM组比较，P<0.05

2.2 五味子乙素对BV-2细胞炎症因子释放的影响 由表1可见，LPS能够明显诱导BV-2细胞释放炎症因子IL-6、TNF-α，与C组比较差异有统计学意义(P<0.05)。在经过不同剂量的五味子乙素处理后，BV-2细胞上清中IL-6、TNF-α的水平显著降低，与M组比较差异有统计学意义(P<0.05),并且随着药物剂量的增加，BV-2细胞上清中IL-6、TNF-α的水平减少，见表1。

表1 五味子乙素对BV-2细胞炎症因子释放的影响(n=6)

注：*与C组比较，P<0.05；#与M组比较，P<0.05；△与SL组比较，P<0.05；▲与SM组比较，P<0.05

2.3 五味子乙素对BV-2细胞中炎症相关蛋白表达量的影响 由图2可见，LPS能够明显诱导BV-2细胞炎症相关蛋白iNOS、COX-2的上调，与C组比较差异有统计学意义(P<0.05)。在经过不同剂量的五味子乙素处理后，BV-2细胞iNOS、COX-2水平显著降低，与M组比较差异有统计学意义(P<0.05),并且随着药物剂量的增加，BV-2细胞iNOS、COX-2的表达量降低。

图2 五味子乙素对iNOS和COX-2蛋白表达水平的影响(n=6)

注：*与C组比较，P<0.05；#与M组比较，P<0.05；△与SL组比较，P<0.05；▲与SM组比较，P<0.05

2.4 五味子乙素对BV-2细胞中Traf6/TAK1信号通路的影响 由图3可见，LPS能够明显诱导BV-2细胞中Traf6、TAK1磷酸化水平的上调，与C组比较差异有统计学意义(P<0.05)。在经过不同剂量的五味子乙素处理后，BV-2细胞中Traf6、TAK1磷酸化水平显著降低，与M组比较差异有统计学意义(P<0.05),并且随着药物剂量的增加，BV-2细胞中Traf6、TAK1磷酸化水平降低。

3 讨论

目前，关于阿尔茨海默症(AD)发病机制的阐述较为浅显，而慢性炎症反应是诱导神经损伤的主要病因之一。BV-2细胞是脑组织中主要的免疫效应细胞，当受到刺激因素作用时会被异常激活，其作用主要表现在两个方面：其一，表现出巨噬细胞细胞功能吞噬Aβ，降低神经团块的形成；其二，其产生的大量炎症因子诱发神经元的损伤，导致神经变性[7-9]。因此，干预BV-2细胞的活化或抑制其炎症因子的释放，可能对预防AD及改善该疾病的进展具有重要意义。

图3 五味子乙素对Traf6/TAK1信号通路活化的影响(n=6)

注：*与C组比较，P<0.05；#与M组比较，P<0.05；△与SL组比较，P<0.05；▲与SM组比较，P<0.05

转录生长因子-β活化激酶1(TAK1)受多种因素的刺激，可以介导胞外信号的传导，TGF-β、TLR、CD4及B细胞受体等细胞因子介导的信号均可由TAK1的磷酸化发挥相应的生物学效应[10]。研究表明，Traf6表达水平上升可促使TAK1的磷酸化，进而诱导细胞炎症、凋亡及氧化应激损伤的发生[11]。并且Trfa6/TAK1通路可介导TLR4信号传导激活NF-κB炎症通路[5-6]。本实验中，采用LPS诱导炎症细胞模型，经过不同浓度五味子乙素干预后，可明显降低炎症因子IL-6、TNF-α的释放，还抑制了炎症相关蛋白iNOS、COX-2的表达，并且表现出浓度依赖性。本研究还发现，五味子乙素能够通过调节Trfa6/TAK1信号通路，降低活化的BV-2细胞的炎症反应，降低炎症因子的产生，从而对慢性炎症性神经损伤具有保护作用。

综上所述，本实验从神经炎症角度探讨了五味子乙素对神经细胞损伤的保护作用。五味子乙素可能通过抑制Traf6/TAK1通路活化对BV-2细胞激活进行调控。本文阐述了该化合物的抗炎作用机制，可能为AD等神经退行性疾病治疗提供新的思路，也为五味子乙素的临床应用提供新的方向。