耿娜娜，罗素元，郑 翔，涂 平，余守洋，吴明松*

0 引言

吗啡(Morphine，Mor)、海洛因等阿片类药物的滥用，已成为全世界重点关注的医学问题和社会问题。吗啡成瘾对机体多个器官如心脏、肾脏和睾丸等[1-3]及各系统如神经系统、免疫系统等[4-5]均有潜在的损害作用，其中，生殖系统是吗啡损害的主要靶系统之一[6]。研究表明，吗啡成瘾会引起睾丸组织萎缩、诱导细胞凋亡发生或造成下丘脑-垂体-性腺轴功能的紊乱[7-9]。内质网是真核细胞中蛋白合成、加工等的重要场所，未折叠蛋白或错误折叠蛋白在内质网腔中积聚或细胞内Ca2+稳态失衡，都会引起内质网应激(Endoplasmic reticulums stress，ERS)。ERS通路是介导细胞凋亡的主要通路之一，而IRE1-XBP-1(Inositol requiring enzyme l-X box binding protein-1)通路是ERS通路中最基础、最保守的信号通路[10]。本课题组前期研究结果表明，雄性SD大鼠睾丸ERS参与了吗啡成瘾的过程，且与ERS标志性分子GRP78的激活有关[11]。但该机制是否与ERS标志性分子GRP94及其主要通路IRE1-XBP-1通路的激活有关，尚未阐明。因此，本文在前期研究的基础上，进一步检测吗啡精神依赖大鼠睾丸组织中葡萄糖调节蛋白94(Glucose regulated protein 94，GRP94)及X-盒结合蛋白-1(X box binding protein-1，XBP-1)的动态表达，对吗啡成瘾状态下睾丸的ERS调控机制进行深入探究，为吗啡依赖导致的生殖系统损伤的预防、治疗及药物开发提供更多的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料 雄性SD大鼠(8周龄)，购自第三军医大学实验动物中心，许可证编号：SCXK(渝)2007-0005，体重120～140 g，分笼饲养。动物饲养房温度24 ℃，通风良好，自然昼夜循环，大鼠自由进食和饮水。盐酸吗啡注射液购自沈阳第一制药厂(规格：10 mg/ml，批号：TD2006-0028)，PCR引物由上海生工生物公司合成，Taq酶购自上海捷瑞生物工程有限公司，RNAiso TM Plus购自TaKaRa Biotechnology公司，M-MLV逆转录酶购自Promega公司，鼠抗人GRP94单抗、鼠抗人GAPDH单抗及二抗均购自Protein-Tech Group公司，兔抗人XBP1多抗购自Santa-Cruz公司。条件性位置偏爱(Conditioned place preference，CPP)装置参照Randall等[12]方法制作而成，其体积为60 cm×30 cm×30 cm，用隔板将CPP装置分为相同体积的两部分，一部分的内壁为黑色，箱底较粗糙(黑箱)；另一部分的内壁为白色，箱底较光滑(白箱)。

1.2 建立大鼠模型 将大鼠置于未放隔板的CPP箱中，使其自由穿梭(连续3 d，1次/d，15 min/次)，并记录大鼠在黑白箱的时间，剔除对白箱或黑箱有明显偏爱的大鼠，选取无明显偏爱的大鼠96只,随机分为2组，其中48只注射吗啡(Mor组)，其余48只注射生理盐水(NS组)。建模训练：用隔板将黑白箱隔开，Mor组按照剂量递增法(起始剂量为10 mg/kg，终止剂量为100 mg/kg)皮下注射吗啡，NS组注射等量的生理盐水。给药20 min后，分别将Mor组、NS组大鼠置于白箱训练40 min。末次训练48 h后，再进行CPP测试，以确认吗啡CPP模型建立成功。将Mor组大鼠随机分为Mor戒断组、Mor消退组和Mor点燃组；NS组大鼠随机分为相应的对照组，即NS戒断组、NS消退组和NS点燃组。其中，戒断组：自然戒断48 h，15 d后进行CPP测试，观察戒断状态，直至Mor组CPP测试结果和NS组相当，可认为戒断成功。消退组：13 d时停止给药，30 d后进行CPP测试，直至大鼠对Mor的依赖消退。点燃组：大鼠对Mor的依赖消退后，于31 d给药Mor(10 mg/kg)进行复燃。麻醉处死各组大鼠，取其睾丸组织。

1.3 RT-PCR 取大鼠的睾丸组织，采用Trizol法提取其总RNA，逆转录合成cDNA，进行PCR反应。引物：GRP94，F:5′-AAGGTCATTGTCACGTCGAAA-3′，R:5′-GTGTTTCCTCTTGGGTCAGC-3′，产物长度为98 bp；XBP-1，F:5′-AAACAGAGTAGCAGCACAGACTGC-3′，R:5′-TCCTTCTGGGTAGACCTCTGGGA-3′，产物长度为454 bp；GAPDH，F:5′-TGGTGAAGGTCGGTGTGAAC-3′，R:5′-GGTGGTGAAGA

GGCCAGTAG-3′，产物长度为305 bp。以cDNA为反应模板，建立总体积为10 μl的反应体系：1 μl cDNA，3 μl无菌水，0.5 μl 5′引物，0.5 μl 3′引物，5 μl Sso Fast Eva Green Supermix。建立反应程序：94 ℃ 60 s，95 ℃ 20 s，63.8 ℃(GRP94)或60.6 ℃(XBP-1)或56 ℃(GAPDH)30 s，40个循环周期。

1.4 Western blot 取大鼠的睾丸组织，裂解提取总蛋白，用BCA法测定其浓度。进行上样，SDS-PAGE电泳，转移蛋白至PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭，加入GRP94一抗(1∶1 000)、XBP-1一抗(1∶2 000)、GAPDH一抗(1∶10 000)，4 ℃下过夜，TBST溶液漂洗3次，分别加入二抗(1∶2 000)37 ℃下孵育1 h，TBST溶液漂洗5次，加ECL发光剂，于暗室中曝光显影，拍照。采用IPP软件分析Western blot条带的灰度值，得出GRP94和XBP-1蛋白的相对表达量。

2 结果

2.1 吗啡戒断、成瘾消退和点燃对睾丸GRP94表达的影响 RT-PCR和Western blot结果显示，与NS对照组比较，吗啡依赖大鼠戒断48 h后，其睾丸组织GRP94 mRNA和蛋白表达水平均显著升高(P<0.01)；经17 d的戒断，大鼠对吗啡依赖消退后，睾丸组织GRP94 mRNA和蛋白表达水平均有所升高(P>0.05)；大鼠对吗啡依赖消退后，于31 d给药吗啡进行复燃，睾丸组织GRP94 mRNA和蛋白表达水平均显著升高(P<0.01)。总体来看，吗啡依赖大鼠睾丸组织GRP94表达水平在戒断48 h后最高，消退时有所降低(P<0.01)，而点燃后水平又有所上调(P<0.05)。见图1、图2。

图1 吗啡戒断、成瘾消退和点燃后睾丸GRP94 mRNA表达的变化

图2 吗啡戒断、成瘾消退和点燃后睾丸GRP94蛋白表达的变化

2.2 吗啡戒断、成瘾消退和点燃对睾丸XBP-1表达的影响 RT-PCR和Western blot结果显示，与NS对照组比较，吗啡依赖大鼠戒断48 h后，其睾丸组织XBP-1 mRNA和蛋白表达水平均显著升高(P<0.01)；经17 d的戒断，大鼠对吗啡依赖消退后，睾丸组织XBP-1 mRNA和蛋白表达水平均升高(P>0.05)；大鼠对吗啡依赖消退后，于31 d给药吗啡进行复燃，睾丸组织XBP-1 mRNA和蛋白表达水平均显著升高(P<0.05)。总体来看，吗啡依赖大鼠睾丸组织XBP-1表达水平在戒断48 h后最高，消退时有所降低(P<0.01)，而点燃后水平又有所上调(P<0.05)。见图3、图4。

图3 吗啡戒断、成瘾消退和点燃后睾丸XBP-1 mRNA表达的变化

图4 吗啡戒断、成瘾消退和点燃后睾丸XBP-1蛋白表达的变化

3 讨论

吗啡是最早提取出来的生物碱物质，分子式为C17H19NO3，具有止痛、抑制肠蠕动、镇咳等多种药理作用，但是吗啡滥用会诱发多种不良反应，造成机体多种系统损害，其中睾丸结构和功能损伤是其重要表现之一。研究表明，吗啡依赖可导致大鼠睾丸生精管壁上皮细胞减少，精子数量降低，诱导睾丸支持细胞发生凋亡，促使睾丸组织萎缩或发生病变等[3,7]，但是其诱导睾丸细胞凋亡的具体分子机制尚未完全阐明。内质网是真核细胞中重要的细胞器，其内环境的稳态是内质网功能发挥的基础条件。在缺氧、氧化应激、毒性物质等的刺激下，内质网未折叠或错误折叠蛋白质增加，当其超出内质网的调节能力时，细胞会激活相关信号转导反应，来适应外界环境的变化，并恢复内质网的稳态，即ERS；当ERS过载过久、内质网调节能力降低时，细胞将启动凋亡程序。研究发现，长久的ERS能够诱导生精细胞凋亡的发生，如辐射、NaF等均可通过激活睾丸细胞的ERS[13-15]，促进其发生细胞凋亡。内质网分子伴侣GRP94是ERS的标志性分子之一。ERS发生时，大量未折叠或错误折叠的蛋白质堆积在内质网腔内，GRP94的转录和翻译水平升高，可结合未折叠的多肽链，从而促进蛋白质的正确折叠。XBP1是ERS中一个重要的转录因子。正常生理状态下，XBP1 mRNA编码少量转录活性低的转录因子；发生ERS时，内质网跨膜蛋白激活转录因子6(Activating transcription factor 6，ATF6)和IRE1首先被激活，活化后的ATF6可促进XBP1 mRNA表达水平升高，产生大量未剪接的XBP1，并在IRE1的作用下剪接，剪接后的XBP1 mRNA能够编码大量高活性的XBP1转录因子，使XBP1表达水平上调。本课题组前期研究结果表明，雄性SD大鼠睾丸内质网应激凋亡通路参与了吗啡成瘾过程，且与GRP78分子的激活有关[11]，但ERS标志性分子GRP94及其主要通路IRE1-XBP-1通路，是否也参与了吗啡成瘾诱导的大鼠睾丸ERS过程，尚未阐明。本研究结果显示，与NS对照组比较，吗啡依赖大鼠戒断48 h后，其睾丸组织GRP94 mRNA和蛋白表达水平均显著升高；经17 d的戒断，大鼠对吗啡的依赖消退后，其睾丸组织GRP94 mRNA和蛋白表达水平均有所升高；大鼠对吗啡依赖消退后，于31 d再给予吗啡进行复燃，其睾丸组织GRP94 mRNA和蛋白表达水平均显著升高，表明ERS标志性分子GRP94及其主要通路IRE1-XBP-1通路，也参与了吗啡成瘾诱导的大鼠睾丸ERS过程。此外，长期用药之后，当减少、中断用药或服用某些拮抗剂，机体会出现生理功能的紊乱，称之为戒断综合征，该综合征通常在停药后8～12 h出现，36～72 h到达顶峰，7～12 d逐渐缓解或消失，如吸毒者在戒断毒品后的24～48 h内，急性戒断综合征表现最为明显。本研究显示，睾丸组织GRP94和XBP1在吗啡依赖大鼠戒断48 h后，表达水平最高，吗啡依赖消退时有所降低，而点燃后二者的表达水平又显著上调，其机制可能是由于在吗啡依赖急性戒断期时，机体处于应激状态，应激水平较高，ERS水平也较高；进入消退期后，应激水平下降，ERS水平也随之降低；而吗啡成瘾复燃后，机体又恢复较强的应激状态，ERS水平又有所上调，如此反复的复吸，促使睾丸细胞一直处于较高的ERS水平，诱导睾丸细胞凋亡的发生，最终导致睾丸及生殖系统等发生不可逆性的损伤。

综上所述，本研究进一步证实了吗啡依赖与睾丸ERS存在一定的关联，并且与睾丸ERS标志性分子GRP94及其XBP-1通路的激活密切相关，为吗啡等阿片类药物依赖患者生殖系统损伤修复提供了更多的理论依据。