胡 炯，王国强，刘启明，董黎强*，罗统富

0 引言

骨性关节炎(Osteoarthritis，OA)是一种以软骨细胞代谢异常，引起软骨细胞退变和软骨基质结构破坏为主的慢性病。研究表明，关节软骨组织的破坏以Ⅱ型胶原蛋白(Collagen Ⅱ)的平衡失常，过度分解尤为显著[1-2]。在OA进展中，软骨细胞代谢失衡，对基质金属蛋白酶-13(MMP-13)的表达明显增强，而MMP-13释放至细胞外后活性启动，进一步加重了基质中collagen Ⅱ的降解，促进关节软骨组织的损伤、退变，加快OA的发生发展[3-4]。染料木素(Genistein,Gen)又称染料木黄酮、金雀异黄素，其为存在于异黄酮类中植物雌激素药理活性最强的一种成分，因其化学构建类似雌激素，故具备结合雌激素受体表现雌激素样效应的能力。研究表明，染料木素能够调节骨细胞的代谢，保护骨组织，延缓骨组织的退变[5]。因此，本研究通过观察不同浓度染料木素对OA软骨细胞增殖活性及分泌collagen Ⅱ、MMP-13水平的影响，探讨染料木素在延缓OA中的机制，为治疗OA提供新的途径。

1 材料和方法

1.1 细胞、试剂和主要仪器 人软骨细胞购自江阴齐氏生物科技有限公司。染料木素(南京广润生物制品有限公司)，胎牛血清(Gibco公司)，细胞增殖-细胞毒性检测试剂盒(CCK-8)(VICMED公司)，BCA蛋白定量试剂盒(碧云天公司)，IL-1β(Recombinant proteins公司)，Anti-MMP-13 antibody、Anti-collagen Ⅱantibody(Affinity公司)，GAPDH(Bioworld公司)，戊酸雌二醇片(美国DELPHARM lille公司，批号：270A)。倒置显微镜(OLYMPUS公司)，流式细胞仪(Becton-Dickinson公司)，凝胶成像仪(Bio-RAD公司)，酶标仪(Molecular Devices公司)，pH计(Metter-Toledo GmbH公司)，电泳仪电源和小型垂直电泳槽(北京六一仪器厂)。

1.2 方法

1.2.1 软骨细胞的培养和鉴定 将人软骨细胞接种于预先铺有胎牛血清的培养皿中，37 ℃ 5% CO2进行培养，调整细胞状态达到对数生长期。甲苯胺蓝染色鉴定：培养皿中培养48 h后收集细胞，PBS漂洗，将细胞置于4%多聚甲醛固定(室温)20 min，PBS漂洗，3×5 min，1%甲苯胺蓝染色液染色5 min；PBS漂洗，3×5 min；蒸馏水洗1 min，不同浓度酒精分别浸泡1 min；二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ各浸泡5 min，晾干，加入中性树胶，封片。显微镜下观察。OA模型建立：将实验分为软骨细胞组(A组)、软骨细胞+IL-1β处理组(B组)2组。IL-1β终浓度为10 ng/ml，IL-1β诱导1×106软骨细胞24 h。Western blot检测：200 μl IP裂解液裂解软骨细胞提取细胞蛋白，BCA试剂作用后，测定562 nm处的吸光度值，计算蛋白浓度，将提取的蛋白上清与5×蛋白上样缓冲液，进行沸水浴10 min，制备电泳胶后固定，依据Marker切下目的条带，200 mA恒流电转移，PVDF膜浸泡于4 ℃一抗孵育液中过夜，洗涤PVDF膜5～6次，5 min/次，二抗孵育液中，室温摇床孵育1 h，加入ECL液化学发光显影。

1.2.2 染料木素对OA模型软骨细胞的影响 实验分组：分6组，A组：软骨细胞组(对照组)；B组：软骨细胞+IL-1β处理组；C组：软骨细胞+IL-1β+染料木素(25 μg/ml)处理组；D组：软骨细胞+IL-1β+染料木素(50 μg/ml)处理组；E组：软骨细胞+IL-1β+染料木素(100 μg/ml)处理组；F组：软骨细胞+IL-1β+戊酸雌二醇(100 μg/ml)处理组。CCK-8法检测细胞活力：各组药物分别作用0、24、48、72、96 h时，取出96孔板，弃去细胞上层培养基，每孔加入100 μl含0.5% FBS的新鲜培养基，再每孔加入10 μl CCK8，37 ℃孵育4 h。将96孔板放入酶标仪，450 nm进行读数。按“1.2.1”项方法进行Western blot检测。

2 结果

2.1 人软骨细胞甲苯胺蓝染色结果分析 甲苯胺蓝是一种碱性染料，组织中酸性物质与阳离子结合显蓝色。正常人软骨细胞甲苯胺蓝染色后细胞质呈淡蓝色，细胞核呈蓝色，细胞核仁呈深蓝色。本研究甲苯胺蓝染色显示培养的人软骨细胞呈异染性，证实为人软骨细胞。见图1。

图1 软骨细胞甲苯胺蓝染色结果

2.2 OA模型建立及蛋白鉴定 Western blot检测各组collagenⅡ和MMP-13蛋白水平。与A组比较，B组的MMP-13蛋白含量升高，collagen Ⅱ蛋白含量降低，差异有统计学意义(P<0.01)。见表1。

表1 两组细胞蛋白含量比较

2.3 CCK-8法检测细胞活力 见图2。加入不同浓度染料木素处理0 h即IL-1β处理24 h，与A组相比，细胞增殖能力下降，证明IL-1β处理减弱了细胞活力。染料木素处理24、48 h，与B组比较，D组细胞活力上调不明显，差异无统计学意义(P=0.160，P=0.163)，而E组细胞活力显著上调，差异有统计学意义(P<0.01)，说明染料木素浓度越高，对软骨细胞活力促进作用越强。染料木素处理72 h，与B组比较，D组和E组的细胞活力均上调，差异有统计学意义(P<0.01)，表明浓度为50 μg/ml的染料木素对细胞活力的促进作用随时间的延长而逐渐明显。结果表明，IL-1β处理可以减弱细胞活力；染料木素能显著增强1L-1β处理的软骨细胞增殖活力；并且细胞增殖活力随染料木素浓度的增多而增强，且与时间呈正比。从表2可知，细胞活力在96 h时较72 h时未出现明显的升高，表示细胞数量在培养皿中逐渐达到饱和，抑制了细胞进一步增殖，而72 h时组间体现出显著差异，故后续实验选择72 h作为检测时间点。另外，IL-1β+100 μg/ml染料木素处理组与单独加IL-1β处理组比较，OD值差距没有扩大，证明100 μg/ml染料木素具备较好的抑制IL-1β对细胞增殖的抑制作用。见表2。

表2 B、D、E三组增殖活力比较(%)

注：*D组与B组比较，#E组与B组比较

图2 CCK-8检测细胞活力

注：与A组比较,**P<0.01;与B组比较,#P<0.05,##P<0.01

2.4 染料木素对OA模型软骨细胞相关蛋白水平的影响 与软骨细胞组比较，IL-1β处理使软骨细胞中collagen Ⅱ表达水平降低，MMP-13表达水平升高；采用染料木素作用后，IL-1β处理的软骨细胞中collagen Ⅱ表达水平升高，而MMP-13表达水平降低；同时，collagen Ⅱ蛋白水平随着染料木素浓度的增加而升高，而MMP-13蛋白表达水平降低，差异有统计学意义(P<0.01)，见表3。

表3 各组细胞蛋白含量比较

注：**与A组比较，P<0.01；##与B组比较，P<0.01

3 讨论

关节软骨细胞代谢异常，软骨基质平衡遭到破坏和降解是骨关节炎形成的主要因素[6]。collagen Ⅱ是软骨细胞合成分泌的细胞外基质，供应软骨细胞生存所需条件。汪建样等[7]研究发现，生长分化因子通过刺激collagen Ⅱ的表达起到保护软骨组织的作用。MMP-13是基质蛋白酶中裂解关节软骨基质中效应最高的一种，最终造成关节软骨的损伤[8]。王伟东等[9]研究发现，右归饮通过抑制软骨细胞分泌MMP-13，减少对软骨基质的降解，延缓骨关节炎的进程。

软骨细胞上存在雌激素受体，是雌激素发挥效应的靶细胞之一。雌激素调控软骨代谢影响骨关节炎发病机制及进程，刺激基质金属蛋白酶抑制剂的生成，降低金属基质蛋白酶的含量，进而延缓对关节软骨的降解[10]，同时，雌激素能够激发蛋白多糖和Ⅱ型胶原蛋白的合成分泌，维持软骨基质结构稳定，保护软骨，因此，雌激素对关节软骨在多方面均有益处。雌激素替代疗法能够恢复绝经后妇女雌激素水平，延缓骨质疏松，减低骨折发生风险，但显著加大了子宫内膜癌、乳腺癌发生的风险。因植物雌激素来源于天然植物，其使用的安全性较高，近年来，关于植物雌激素样活性的研究报道越来越多，植物雌激素具备类似雌激素化学结构及药理活性的成分，能够与人和哺乳动物内雌激素受体结合发挥其雌激素样作用[11]。其中异黄酮类化合物是传统中草药内含有的一类重要的天然有机化合物[12]，该化合物中植物雌激素样效应成分被当作雌激素受体调节剂使用。染料木素是异黄酮类化合物中药理活性最高的物质。研究表明，染料木素能够通过过氧化物酶体增殖物激活受体γ来刺激成骨细胞的增殖分化活性[13]，同时，染料木素能够刺激骨形成和抑制破骨细胞的增殖分化和骨吸收功能[14]。

本实验利用IL-1β诱导正常人软骨细胞建立OA软骨细胞模型，采用甲苯胺蓝染色和Western blot检测方法鉴定OA软骨细胞模型的成功建立。CCK-8法检测细胞活力发现，OA软骨细胞模型较正常软骨细胞活力下降明显，通过不同浓度染料木素处理后，IL-1β+软骨细胞活性大大增强，染料木素浓度越高，细胞活力增强越明显，以100 μg/ml染料木素处理组细胞活力最强。在药物处理72 h时，100 μg/ml染料木素处理组较正常软骨细胞组细胞活性差距最小。100 μg/ml染料木素与雌二醇处理后，染料木素药理效应更强。Western blot检测发现，染料木素浓度越高，OA细胞模型中生成的collagen Ⅱ越高，而MMP-13含量逐渐下降。100 μg/ml浓度染料木素处理OA细胞较雌二醇处理达到更好的效果。提示雌二醇与染料木素均能够延缓骨关节炎的发展，100 μg/ml染料木素延缓骨关节炎进展效果最佳，且同等浓度下染料木素药理效应优于雌二醇。

本实验染料木素通过刺激骨关节炎软骨细胞活性，促进collagen Ⅱ的合成和分泌，抑制软骨细胞产生MMP-13来达到保护关节软骨、延缓骨关节炎发展的作用。但影响OA的发病机制众多，染料木素是否同时参与其他因子的表达，保护关节软骨，需要进一步的研究。