孙成华，刘保献，鹿海峰，张大伟,*，洪姗姗，刘康，常淼，杜泽瑞

1. 北京市环境保护监测中心，北京 100048 2. 大气颗粒物监测技术北京市重点实验室，北京 100048

大气污染与健康的关系越来越受到人们的关注，众多的研究表明，颗粒物的浓度与人群死亡率和肺癌发病率增加显著相关。《全球疾病负担2013研究》报告显示[1]：空气污染已成为2013年影响中国人健康的三大风险因素之一。研究发现，颗粒物短期或长期暴露均会对人体产生不良的健康效应[2-10]，主要包括：致使重病和慢性病患者的死亡率升高；使肺功能和免疫功能下降，造成呼吸系统和心脑血管系统疾病恶化；增加恶性肿瘤的患病率等。颗粒物对生物体的毒性效应已经成为近年来的研究热点。颗粒物的健康效应不仅来自其物理性质，其复杂的化学组成也是健康效应的影响因素[4, 6]。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 材料

MicroTox稀释液，MicroTox渗透压调节液，MicroTox补充液，实验用小玻璃试管，费氏弧菌冻干粉(批号16C4029，17B4040)(美国Modern Water公司)。10～100 μL可调节取样枪，100～1 000 μL可调节取样枪(吉尔森)。硫酸氨、硝酸氨、硫酸氢氨、七水硫酸锌(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)。硝酸铅(分析纯，天津市福晨化工厂)。

Microtox Model 500毒性检测系统(美国Modern Water公司)，仪器配备了30孔温控培养室，温度控制在(15±0.5) ℃；恒温调节温控菌种培养槽，温度控制在(5.5±1) ℃；实验样品测试井，温度控制于(15±1.0) ℃。AD-2100F连续测定pH计(上海仪乐)。

1.2 方法

1.2.1 模拟溶液配制方法

分析2014—2015年PM2.5组分浓度与发光抑制率的关系，发现样品提取液发光抑制率值均与Pb、Zn、Cu、Mn相关性较强，Cu、Mn的盐溶液有颜色会干扰发光细菌发光测试结果，本实验选择Pb、Zn开展发光细菌发光抑制测试。Charrier等[19]研究发现，颗粒物中大部分金属以可溶性的离子态形式存在，因此选用发光细菌光抑制测试实验中常用标准参照物硫酸锌和易溶的硝酸铅配制模拟溶液；锌、铅等元素在PM2.5中含量较低，其当量浓度比硝酸根、硫酸根当量浓度低近千倍，在模拟硫酸氨、硫酸氢氨、硝酸氨溶液中加入硫酸锌、硝酸铅对溶液中硫酸根和硝酸根的浓度影响极低。参照2014—2015年Pb、Zn在不同浓度级别颗粒物样品中的平均浓度(表1)，估算了不同级别PM2.5提取液中的硫酸锌、硝酸铅浓度，分别模拟配制硫酸锌、硝酸铅、硫酸锌和硝酸铅的混合溶液以及不同浓度级别硫酸锌、硝酸铅与硫酸氨、硫酸氢氨、硝酸氨的混合溶液。

1.2.2 模拟溶液pH值测试

1.2.3 发光细菌光抑制测试方法及质量控制

采用Model 500毒性检测系统，按照标准方法(ISO11348-3：2007，水样对费氏弧菌发光抑制效应的测试-使用冻干细菌的方法)，实验步骤参见文献[11,14]。测试质控措施：菌种复苏后，应用ATP模式测试实验用菌液初始发光值，实验用菌液初始光子计数值要大于107。每批次样品测定时，同步测试菌种稀释液(空白)、相同浓度标准毒性参照物溶液(质控样)的发光抑制率，以控制菌液质量；同步测试溶液配制用水的发光抑制率作为背景参考值，每个浓度溶液平行测定2～3次，结果取各次测试的平均值。全部实验过程中共测试菌种稀释液空白14个，发光抑制率平均值为-3.14%±1.78%，配制用水空白8个，发光抑制率平均值为-1.71%±2.62%，标准毒性参照溶液(10 mg·L-1硫酸锌)14个，发光抑制率平均值为87.0%±1.46%。

1.2.4 联合影响效应测试混合溶液的配制及联合影响效应判定方法

混合物的配比不同对联合影响效应判定的实验结果有影响[20]，因此混合硫酸氨、硫酸氢氨、硝酸氨的溶液中，各组分浓度比例参照2014—2015年各组分在日均值6级颗粒物样品中的平均浓度进行估算，混合硫酸锌、硝酸铅的比例参照2014—2015年6级颗粒物样品中Pb、Zn的平均浓度比例估算。

参考硫酸氨、硫酸氢氨、硝酸氨混合溶液的EC50值和硫酸锌、硝酸铅混合溶液的EC50值，配制等毒性比硫酸氨、硫酸氢氨、硝酸氨与硫酸锌、硝酸铅的多元混合溶液。

多种污染物与生物体的联合毒性作用，可以分为独立、相加、协同和拮抗4种作用类型，采用毒性单位法(TU)、相加指数法(AI)、混合毒性指数法(MTI)等方法可对这些类型进行定量判别和分析[20-23]。

毒性单位法中规定混合物中第i组分的毒性单位为:

式中Ci为混合物在半数抑制效应时第i组分的浓度，EC50i为化合物单独作用时的半数抑制效应浓度。混合物的毒性单位等于各组分的毒性单位之和：

M=TUmix=∑TUi

若令M0=M÷max(TUi)，依据M0结果可以评价混合物的联合作用类型，表1为联合毒性作用类型量化评价依据。

相加指数法是在毒性单位法基础上发展起来的，定义如下：

当M>1时，AI=M(-1)+1.0

混合毒性指数法定义为：

M0=M÷max(TUi)

2 结果与分析 (Results and analysis)

2.1 硫酸氨、硝酸氨、硫酸氢氨等模拟溶液浓度的确定

2014—2015年分别测试3～6级PM2.5样品提取液129、69、57、39份，统计各级别PM2.5样本组分浓度(表2)，估算3～6级PM2.5样本提取液中各组分平均浓度，转换成当量浓度后估算3～6级各模拟溶液浓度分别为：硫酸氨溶液(7.17、10.7、12.0、13.5 μg·mL-1)，硝酸氨溶液(10.6、14.6、25.6、36.1 μg·mL-1)，硫酸氢氨溶液(3.88、2.47、6.28、13.2 μg·mL-1)，七水硫酸锌溶液(0.539、0.718、0.951、1.28 μg·mL-1)，硝酸铅溶液(0.088、0.123、0.157、0.219 μg·mL-1)，此外还选择2014—2015年Zn、Pb的最高浓度估算配制了样品最高浓度的七水硫酸锌模拟溶液(2.83 μg·mL-1)，硝酸铅模拟溶液(0.457 μg·mL-1)。

表1 不同评价指数的联合作用类型判断标准Table 1 The joint toxicity types and standards of different evaluating methods

表2 不同浓度级别颗粒物样品中硫酸根、硝酸根、氨离子、锌、铅平均浓度(μg·m-3)Table 2 The average concentration of major compositions of PM2.5(μg·m-3)

注：PM2.5浓度分级参考标准HJ633—2012。Note: The classification of daily average level of PM2.5refer to Standard HJ633-2012.

2.2 不同浓度级别硫酸氨、硝酸氨、硫酸氢氨等模拟溶液对发光细菌的光抑制测试结果

图1为不同浓度硫酸氨、硝酸氨及其混合溶液对发光细菌发光抑制的测试结果，图2为不同浓度硫酸氢氨及其与硫酸氨、硝酸氨混合溶液对发光细菌的光抑制的测试结果。3～6级硫酸氨、硝酸氨、硫酸氢氨溶液及它们的混合溶液均未对发光细菌的发光产生抑制，当硫酸氨和硝酸氨浓度为6级浓度的1 000倍时，对发光细菌的发光抑制率平均值分别为69.2%和37.0%。配制硫酸氨、硝酸氨浓溶液，选择5个合适的稀释浓度，测试各浓度溶液发光抑制率，绘制曲线，计算得到硫酸氨、硝酸氨EC50值分别为2.31×104μg·mL-1、2.75×104μg·mL-1。

图1 不同浓度硫酸氨、硝酸氨及其混合模拟溶液对发光细菌的发光抑制率Fig. 1 Luminous inhibition rate of different concentrations of ammonium sulfate, ammonium nitrate and their mixed solution

图2 不同浓度硫酸氢氨及其混合模拟溶液对发光细菌的发光抑制率Fig. 2 Luminous inhibition rate of different concentrations of ammonium hydrogen sulfate and ammonium hydrogen sulfate mixed with ammonium sulfate, ammonium nitrate solution

在估算硫酸盐和硝酸盐浓度时，发现随着PM2.5浓度增加，氨离子和硫酸根及硝酸根之间的当量浓度差距加大(图3)，模拟各级溶液时选择H+平衡阴阳离子之间的差异，硫酸氢氨溶液偏酸性，硫酸氢氨浓度为6级估算浓度的10倍(132 μg·mL-1)时，pH值为3.23，对发光细菌发光显著抑制(发光抑制率为99.9%)。将10倍的6级硫酸氢氨模拟溶液逐级稀释，测试稀释溶液的发光抑制率，绘制的曲线见图4。由曲线可以观察到，当H+浓度增加到6级细颗粒物(PM2.5)提取液中硫酸氢氨浓度的5倍时，模拟混合溶液即开始对发光细菌的发光产生明显抑制(图2)，发光抑制率与硫酸氢氨的稀释浓度指数相关(图4), 硫酸氢氨EC50值为79.8 μg·mL-1。同时将10倍的6级硫酸氢氨与硫酸氨、硝酸氨各模拟混合溶液逐级稀释，测试发光抑制率，混合溶液发光抑制率均与稀释浓度指数相关(图2，图4)，计算硫酸氢氨及混合溶液的EC50值，采用毒性单位法(TU)、相加指数法(AI)、混合毒性指数法(MTI)等联合影响效应评价方法，计算各混合溶液的TU、M、M0、AI、MTI等参数(表3)，其中M≈1≈M0，AI=0，MTI=0，各混合溶液对发光细菌的光抑制均为硫酸氢氨的独立作用，说明硫酸氢氨与硫酸氨、硝酸氨混合盐溶液中对发光细菌光抑制的主要影响因素是H+。

图3 不同浓度级别PM2.5中氨离子当量浓度与硫酸根和硝酸根当量浓度比较Fig. 3 The equivalent concentration of ammonia ion compared to the equivalent concentration of sulfate ion and nitrate ion in PM2.5 samples

图4 10倍6级硫酸氢氨模拟溶液对发光细菌的光抑制的稀释浓度曲线Fig. 4 The correlation curve of luminous inhibition rate and diluted concentration of ammonium hydrogen sulfate

模拟溶液中应用氢离子平衡阴阳离子浓度，降低了溶液的pH值，但实际PM2.5样品提取液中钠、钾、钙、镁等离子同时参与阴阳离子平衡[17,24]，2014年6级PM2.5样品的提取液pH平均值为5.35，高于6级模拟溶液pH值(4.55)，模拟实验中H+对发光细菌的影响会比实际PM2.5样品提取液高。杨懂艳等[25]测试了2012年8月—2013年7月一年的PM2.5水溶性离子浓度，统计发现阴阳离子年均比值为1.12，水溶性离子总体偏酸性，实际PM2.5样品提取液中，H+对生物的影响效应仍需重视，应加大力度控制硫酸根、硝酸根、氨离子等前体物的排放量，重视对PM2.5中水溶性离子阴阳平衡的分析。

2.3 不同浓度级别锌、铅等模拟溶液对发光细菌的光抑制测试结果

由图5，6可见，5级以下硫酸锌、硝酸铅溶液及其混合溶液均未显著抑制发光细菌发光，模拟硫酸锌溶液对发光细菌发光抑制的影响要高于硝酸铅，锌离子对发光抑制的无效应浓度为0.19 μg·mL-1、铅离子对发光抑制的无效应浓度为0.44 μg·mL-1。3～6级模拟硝酸铅溶液中，铅离子的浓度均低于其无效应浓度(0.44 μg·mL-1)，而5级以上模拟硫酸锌溶液中，锌离子浓度则高于其无效应浓度(0.19 μg·mL-1)。

图5 不同浓度硫酸锌溶液对发光细菌的光抑制测试结果Fig. 5 Luminous inhibition rate of different concentrations of zinc sulfate solution

表3 混合体系的 EC50值和联合毒性评价参数及作用类型Table 3 Joint toxicity evaluating parameters and types for different multi-mixture systems

图6 不同浓度硝酸铅溶液对发光细菌的光抑制测试结果Fig. 6 Luminous inhibition rate of different concentration of lead nitrate solution

由硫酸锌、硝酸铅的EC50曲线估算，硫酸锌、硝酸铅EC50值分别为4.45 μg·mL-1、1.80 μg·mL-1。参照2014—2015年6级颗粒物样品中Pb、Zn的平均浓度比例配制硫酸锌与硝酸铅混合溶液，选择5个合适的稀释浓度，测试发光抑制率，计算得到混合溶液的EC50值为2.87 μg·mL-1，采用毒性单位法(TU)、相加指数法(AI)、混合毒性指数法(MTI)等联合影响效应评价方法，计算各混合溶液的TU、M、M0、AI、MTI等参数(表3)，其中M<1，AI>0，MTI >1，硫酸锌和硝酸铅混合溶液中，锌和铅对发光细菌的联合影响效应表现为协同。王莹等[26]测试了Zn2+、Pb2+对水螅的联合毒性作用，王银秋等[27]测试了Zn2+、Pb2+对鲫鱼和泥鳅的联合毒性作用，发现Zn2+、Pb2+对这些水生生物的联合毒性多表现为拮抗作用，这种差异可能缘于不同实验物种对不同金属的敏感性不一致。高继军等[28]在应用淡水发光菌研究二元重金属混合物的联合毒性时注意到：应用不同的测试生物对相同的重金属混合物进行测试，会出现不同的作用方式。。孟庆俊等[20]在研究苯胺与甲基苯胺对大型溞的联合毒性时发现:混合物的配比不同得到的联合毒性作用结果不同，本次实验Zn2+、Pb2+的混合溶液配制比例按照实际PM2.5中Zn2+与Pb2+的浓度比例配制，而王莹等[26]的试验中Zn2+、Pb2+的混合溶液按等毒性比例配制。

2.4 硫酸氨、硝酸氨、硫酸氢氨与硫酸锌、硝酸铅混合溶液对发光细菌的光抑制

参照硫酸氨、硫酸氢氨、硝酸氨混合溶液的EC50值以及硫酸锌、硝酸铅混合溶液的EC50值，配制硫酸氨、硫酸氢氨、硝酸氨与硫酸锌、硝酸铅等毒性比的混合溶液。选择5个合适的稀释浓度，测试发光抑制率，计算得到混合溶液的EC50值为63.6 μg·mL-1，采用毒性单位法(TU)、相加指数法(AI)、混合毒性指数法(MTI)等联合毒性评价方法，计算各混合溶液的TU、M、M0、AI、MTI等参数(表3)，其中M<1，AI>0，MTI >1，多元混合体系对发光细菌的影响呈现协同作用。图7中5级以上硫酸锌、硝酸铅模拟溶液和相同级别硫酸氨、硝酸氨、硫酸氢氨溶液混合后，发光抑制率值显著增加，表明硫酸盐、硝酸盐与锌、铅的混合体系呈现协同作用。

3 讨论与结论(Discussion and conclusion)

模拟的PM2.5主要组分溶液对发光细菌的光抑制测试实验表明：(1)与3～6级PM2.5可溶性提取液中硫酸氨、硫酸氢氨、硝酸氨、硫酸锌和硝酸铅浓度相同的模拟溶液对发光细菌的发光没有抑制作用。(2)硫酸氨、硝酸氨、硫酸氢氨混合溶液中，对发光细菌的光抑制均为硫酸氢氨的独立作用，硫酸锌与硝酸铅的混合体系，锌和铅对发光细菌的联合影响效应表现为协同，硫酸氨、硝酸氨、硫酸氢氨与硫酸锌、硝酸铅的多元混合体系呈现协同作用。

图7 3～6级锌、铅等模拟溶液对发光细菌的光抑制测试结果Fig. 7 Luminous inhibition rate of different concentrations of lead and zinc salt solution, lead and zinc salt solution mixed with ammonium hydrogen sulfate, ammonium sulfate and ammonium nitrate solution

目前，我国尚没有开展颗粒物组分与健康效应关联的长期流行病学调查，颗粒物组分健康效应的毒理学实验也开展较少，Liu等[29]春季在北京城区和郊区开展了PM2.5样品组分分析和颗粒物提取液DTT氧化损失能力测试，应用2种细胞系开展了体外毒性测试，评估并解析了颗粒物不同来源组分与活性氧产生能力的关系，发现二次来源的颗粒组分、Zn、Al、Pb、Fe和沙尘源颗粒组分是引起细胞氧化损伤和产生炎性因子重要因素。Wang等[30]研究了北京不同粒径的颗粒物电位、比表面积以及可溶性有机物、过渡金属、多环芳烃、内毒素等组分浓度特点，并应用DTT氧化损失能力测试方法分析了不同粒径颗粒物的氧化应激能力，采用人肺癌细胞系A549和小鼠单核巨嗜细胞系，测试了这些颗粒物对细胞活力的影响以及在颗粒物作用下肺癌细胞系A549的白细胞介素-8和巨嗜细胞肿瘤坏死因子-α的产生情况，分析了粒径、组分浓度与氧化应激和细胞毒性因子的相关性。但各组分之间的联合影响效应研究尚不多见。虽然PM2.5提取液的发光细菌的发光抑制实验可以实现测试程序标准化，能够简单、快速得出测试结果，但发光细菌细胞与高等动物及人体细胞相比，结构简单，缺少遗传毒性、免疫毒性等靶标，且颗粒物暴露方式与高等动物及人体细胞相比有一定的差异，发光抑制测试结果只能预警提示PM2.5对健康可能存在危害。本研究仅针对PM2.5金属组分与硫酸盐、硝酸盐组分对生物的联合影响开展了初步研究，这些组分与PM2.5中主要有机组分OC(占比27%～30%)之间的联合影响效应还有待进一步探讨。为科学研究颗粒物不同组分对生物及人体影响，评估颗粒物的健康效应，应建立起不同种群多种模式生物[10,30-33]颗粒物毒性评估监测体系，为大气污染治理提供参考。