储斌，席贻龙，朱凌云，冯若楠

安徽师范大学生命科学学院，安徽省重要生物资源的保护和利用研究省级重点实验室，皖江城市带退化生态系统的恢复与重建安徽省协同创新中心，芜湖 241000

抗生素的发现被认为是20世纪最重要的科学成就之一。抗生素不仅被广泛地用于人和动物疾病的预防和治疗，还被作为生长促进剂添加于饲料中用于畜禽和水产养殖业[1]。常规服用的抗生素，约有50%～90%以原药或其代谢物形式通过粪尿被排出体外，然后通过污水处理后间接进入环境，或通过施肥直接进入环境中[2]。红霉素的长期使用使得地表水、地下水以及处理过的污水中均有残留[3-7]，其生物活性即使是在非常低的浓度下(ng·L-1)也可能威胁水生态环境和人类健康[8-11]。因此，研究红霉素对水生生物的影响具有重要的意义。

有关红霉素对水生生物的毒性作用研究，已有一些报道：研究所使用的受试生物包括细菌、藻类、浮萍、原生动物、轮虫、枝角类、库蚊、鱼类和两栖动物等类群的多种生物；实验终点涉及半数致死浓度等急性毒性实验指标以及存活、生长、生殖和遗传毒性等慢性毒性实验指标[8,12-21]。然而，上述研究均只涉及单一世代的受试生物。自然水体中，水生生物是持续暴露于环境污染物之中的，仅研究预先没有暴露于污染物中的母体可能会低估污染物的毒性作用[22-24]。因此，研究污染物对连续世代的水生生物的毒性作用具有重要的意义；但有关红霉素对连续世代的枝角类存活和生殖等的影响尚未见报告。

多刺裸腹溞属于甲壳纲、枝角亚目、裸腹溞属，是许多淡水生态系统的重要组成部分。由于其生命周期短，对污染物敏感性强，能通过孤雌生殖获得纯系，因此被广泛用于水体污染物的毒性监测和生态毒理学研究[25-28]。近几年来，以其为受试生物开展枝角类连续世代的毒理学研究在逐渐增多[26-29]。本文以多刺裸腹溞为研究对象，研究了红霉素对其连续3个世代(F0、F1和F2)生活史参数的影响，旨在弥补国内外此方面研究之不足，揭示红霉素毒性随其孤雌生殖世代数增加而变化的规律。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 实验材料

受试动物：试验用多刺裸腹溞(Moinamacrocopa)由香港科技大学提供，在(25±1) ℃、自然光照的恒温培养箱内进行克隆培养。培养时，以EPA(通过溶解96 mg NaHCO3、60 mg CaSO4、60 mg MgSO4和4 mg KCl于1 L蒸馏水中配制而成)[30]为培养液，以用HB-4培养基[31]培养的、处于指数增长期的斜生栅藻(Scenedesmusobliquus)为食物。斜生栅藻离心浓缩并经显微计数后使用，投喂密度为1.0×106cells·mL-1[32]。

实验药品：试验用红霉素(纯度≥98%)购于Sigma-Slarbio公司。实验前，用丙酮将红霉素配制成1 g·L-1的原液，然后用蒸馏水稀释成10 mg·L-1的母液，母液每周更换1次。实验时用EPA将母液配制成所需要的浓度。

1.2 多刺裸腹溞生活史实验方法

依据红霉素对多刺裸腹溞存活和生殖的7 d-NOEC值为50 mg·L-1 [8]，实验将红霉素浓度设置为6个梯度，分别为0.02、0.2、2、20、200和2 000 μg·L-1，另设空白对照组和丙酮(助溶剂)对照组(其中丙酮含量与2 000 μg·L-1浓度组中的含量相同，为0.5‰)。实验在与预培养相同的条件下进行。实验选取多刺裸腹溞各世代于第3窝所产的幼体(龄长<12 h)进行；其中，F0代幼体为预培养状态下多刺裸腹溞在第3代第3窝所产的雌性幼体，F1代幼体为F0代在实验状态下第3窝所产的雌性幼体，F2代幼体为F1代在实验状态下第3窝所产的雌性幼体。实验在6孔培养板内进行，每孔加入10 mL测试液(内含密度为1.0×106cells·mL-1的斜生栅藻)和1只多刺裸腹溞幼体，每个浓度设12个重复。实验开始后，每天更换50%测试液一次(内含密度为1.0×106cells·mL-1的斜生栅藻)，每12小时观察并记录1次多刺裸腹溞的存活数、繁殖窝数和每窝所产的幼体数，并移出幼体。实验持续到所有原初个体死亡为止；死亡标准以晃动杯子15 s不动为准[8,33]。

表1 连续3个世代暴露于不同浓度红霉素溶液中多刺裸腹溞的存活和生殖参数(平均值±标准误)Table 1 Parameters of survival and reproduction of three successive generations of M. macrocopa exposed to different erythromycin concentrations (Mean±SE)

注：*与各世代的空白对照组相比有显著性差异(P<0.05)。Note: *significantly different from the blank controls in each generation (P<0.05).

1.3 数据处理方法

采用SPASS 19.0分析软件对各生活史参数进行统计分析。对符合正态分布的数据进行单因素、双因素方差分析和多重比较(LSD检验)，以揭示不同红霉素浓度、世代数以及它们之间的交互作用对多刺裸腹溞各生活史参数影响的显著性。

2 结果(Results)

与空白对照组相比，暴露于0.5‰的丙酮(助溶剂)溶液中多刺裸腹溞，除了F1代和F2代的首次生殖年龄显著减小了13.73%和16.00%外(P<0.05)，3个世代多刺裸腹溞的其他各生活史参数均未出现显著性差异(P>0.05)(表1)。

2.1 红霉素浓度对连续3个世代多刺裸腹溞存活的影响

红霉素浓度对多刺裸腹溞F0代平均寿命的影响表现出“低促高抑”的剂量-效应关系(P<0.05)，但其对平均寿命影响的显著性随着多刺裸腹溞世代数的增加而消失(P>0.05)。与空白对照组相比，暴露于0.02 μg·L-1红霉素溶液中的多刺裸腹溞F0代的平均寿命延长了10.26%(P<0.05)，但暴露于2～2 000 μg·L-1红霉素溶液中的F0代的平均寿命则缩短了25.87%～54.84%(P<0.05)；暴露于各浓度红霉素溶液中的多刺裸腹溞F1和F2代的平均寿命均未出现显著性差异(P>0.05)(表1)。

2.2 红霉素浓度对连续3个世代多刺裸腹溞首次生殖年龄的影响

红霉素浓度对多刺裸腹溞F0代的首次生殖年龄无显著性影响(P>0.05)，但却显著地影响了多刺裸腹溞F1和F2代的首次生殖年龄(P<0.05)。与空白对照组相比，暴露于0.2、20～2 000 μg·L-1红霉素溶液中的多刺裸腹溞F1代的首次生殖年龄减小了4.90%～15.69%(P<0.05)，暴露于0.2～2 000 μg·L-1红霉素溶液中的F2代的首次生殖年龄减小了5.00%～16.00%(P<0.05)(表1)。

2.3 红霉素浓度对连续3个世代多刺裸腹溞生殖窝数、窝卵数和总后代数的影响

与空白对照组相比，暴露于20 μg·L-1红霉素溶液中的多刺裸腹溞F0代的生殖窝数减小了55.76%(P< 0.05)，但暴露于各浓度红霉素溶液中的多刺裸腹溞F1和F2代的生殖窝数并未出现显著性差异(P>0.05)。

表2 红霉素浓度对连续暴露3个世代的多刺裸腹溞的存活和生殖参数的影响(双因素方差分析)Table 2 Effects of erythromycin (ER) concentration on parameters of survival and reproduction of three successive generations of M. macrocopa (Two-way ANOVA)

红霉素浓度对多刺裸腹溞窝卵数的显著性影响只出现在F1代(P<0.05)，表现为与空白对照组相比，暴露于20和200 μg·L-1红霉素溶液中的多刺裸腹溞F1代的窝卵数分别增加了28.87%和10.18%(表1)。

红霉素浓度对多刺裸腹溞总后代数的显著性影响出现在F0和F1代(P<0.05)，在F2代中消失(P>0.05)。与空白对照组相比，暴露于2～200 μg·L-1红霉素溶液中的多刺裸腹溞F0代的总后代数减少了43.99%～62.21%(P< 0.05)，而暴露于20和200 μg·L-1红霉素溶液中的多刺裸腹溞F1代的总后代数分别增加28.56%和37.17%(P<0.05)(表1)。

双因素方差分析结果表明，多刺裸腹溞的平均寿命、首次生殖年龄和生殖窝数受世代数、红霉素浓度以及两者间的交互作用的显著影响，窝卵数受世代数和红霉素浓度间交互作用的显著影响，总后代数受世代数以及世代数和红霉素浓度间交互作用的显著影响(表2)。

3 讨论(Discussion)

3.1 助溶剂对枝角类生活史参数的影响

丙酮的毒性在各种有机溶剂中最低，所以丙酮是水生态毒理学试验中一种常用的有机溶剂[34-35]；但在水生态毒理学试验中，丙酮对受试生物的影响并非可以完全忽视。Sánchez等[36]发现，与空白对照组相比，10-4μg·L-1的丙酮对大型溞母代和F1代第1窝个体所有生活史参数均无显著性影响，但却提高了F1代第3窝个体的窝卵数和总后代数。Chu等[37]也发现与空白对照组相比，丙酮对多刺裸腹溞的繁殖具有促进作用；推测其原因可能是细菌以丙酮为补充营养源，进而为枝角类提供更多的食物。陈艳等[27]研究发现，与空白对照组相比，0.5‰的丙酮对多刺裸腹溞F0生命表参数无显著性影响，但却显著提高了F1代和F2代的种群内禀增长率。本研究发现，与空白对照组相比，0.5‰的丙酮对多刺裸腹溞F0代的存活和生殖均无显著性影响，但却显著缩短了多刺裸腹溞F1和F2代的首次生殖时间。

3.2 污染物浓度与浮游动物生活史参数之间的剂量-反应关系

低污染物浓度范围内的剂量-反应性质一直是毒理学研究中最具挑战的话题之一[38]。越来越多的证据表明这类剂量-反应关系呈“U”形，表现为毒物刺激效应(hormesis)，以“低促高抑”为特征[38]。低浓度的艾氏剂(aldrin)、十氯丹(chlordecone)和邻苯二甲酸丁苄酯促进萼花臂尾轮虫的种群增长[39-41]；1.0×106cells·mL-1的斜生栅藻密度下，6.0 μg·L-1的Hg2+促进萼花臂尾轮虫的存活、生殖和种群增长[42]；一定浓度的艾氏剂促进多刺裸腹溞F2代的种群增长[27]。本研究中，毒物刺激效应也是明显的，主要表现为与对照组相比，暴露于0.02 μg·L-1的红霉素溶液中的多刺裸腹溞F0代的平均寿命显著延长，暴露于0.2、20～2 000 μg·L-1红霉素溶液中的多刺裸腹溞F1代的首次生殖年龄显著减小，暴露于20和200 μg·L-1红霉素溶液中的多刺裸腹溞F1代的窝卵数和总后代数显著增加。低浓度的污染物可能刺激了多刺裸腹溞的摄食，因此促进了它的存活、发育和生殖；而高浓度的污染物可能减少了多刺裸腹溞的摄食，加之污染物的毒性作用，由此抑制了它的存活、发育和生殖。

Ji等[8]研究发现，与对照组相比，21 d慢性毒性暴露后，暴露于100和300 mg·L-1红霉素溶液中的大型溞的存活率显著降低，暴露于33.3 mg·L-1红霉素溶液中的大型溞的窝卵数和总后代数显著减少，但暴露于3.7～33.3 mg·L-1红霉素溶液中的大型溞的首次生殖时间未出现显著性差异；暴露于400和1 600 μg·L-1红霉素硫氰酸盐溶液中的大型溞的寿命显著缩短，暴露于1 600 μg·L-1红霉素硫氰酸盐溶液中的大型溞的首次生殖年龄显著缩短，暴露于400、800和1 600 μg·L-1红霉素硫氰酸盐溶液中的大型溞的生殖窝数和总后代数显著减少[17]；7 d慢性毒性暴露后，暴露于150 mg·L-1红霉素溶液中的多刺裸腹溞的存活率显著降低；但暴露于1.85～50.0 mg·L-1红霉素溶液中的多刺裸腹溞的首次生殖时间、窝卵数和总后代数均无显著变化[8]。由于慢性毒性试验持续的时间和测试的红霉素浓度范围等不同，本研究所得到的结果也与上述结果之间有所不同。本研究结果显示，与空白对照组相比，暴露于0.02 μg·L-1红霉素溶液中的多刺裸腹溞F0代的平均寿命显著延长了，但暴露于2～2 000 μg·L-1红霉素溶液中的F0代的平均寿命显著缩短；暴露于20 μg·L-1红霉素溶液中的F0代的生殖窝数显著减小，暴露于2～200 μg·L-1红霉素溶液中的F0代的总后代数显著减少。

3.3 污染物浓度对枝角类生活史参数影响的世代间差异

已有研究结果表明，枝角类的存活和生殖等对污染物的响应因孤雌生殖世代数或窝数的不同而异。如21 d慢性毒性暴露后，大型溞的平均寿命、首次生殖年龄、生殖窝数、窝卵数和总后代数对二嗪农浓度的响应在F0代、F1代第1窝和第3窝个体间明显不同[36]；完全生命周期慢性暴露后，多刺裸腹溞的生命期望和净生殖率对升高的艾氏剂浓度的反应以及平均寿命、首次生殖年龄和总后代数对升高的壬基酚浓度的反应均在F0、F1和F2代之间存在着显著的差异[27, 29]；一定浓度的邻苯二甲酸丁苄酯使多刺裸腹溞F0代的生命期望和净生殖率显著降低，但对F1代却无显著性影响[28]；200.0 μg·L-1的氧氟沙星和900.0 μg·L-1的布洛芬对大型溞繁殖的影响表现出世代差异性[43]。与上述结果一致，本研究中，红霉素浓度对多刺裸腹溞的平均寿命、首次生殖年龄、生殖窝数、窝卵数和总后代数的影响在多刺裸腹溞世代间也均存在着差异。

大型溞前几代在生殖方面表现出对200.0 μg·L-1的氧氟沙星和900.0 μg·L-1的布洛芬一定的适应性或耐受性[43]。本研究结果表明，多刺裸腹溞F1和F2代在存活、F2代在生殖等方面对各浓度的红霉素也表现出一定的适应性或耐受性。当然，更多世代的多刺裸腹溞对红霉素污染的响应仍需要进一步的研究。