林芳，毛楷林，江秀，周海龙

海南大学热带农林学院，海口 570228

环境中污染物可通过吸收代谢以及食物链的传递危害人类健康，其中，多环芳烃污染广泛分布于环境中。苯并芘(benzopyrene, BaP)及滴滴涕(dichlorodiphenyl trichloroethane, DDT)是多环芳烃中的典型代表，化学性质稳定，易在环境中蓄积。丘耀文等[1]研究发现，大亚湾海域中海水多环芳烃平均总含量已大于10 000 ng·L-1，表层沉积物平均总含量为(481 ± 316) ng·g-1，其中BaP在海水中含量已达633 ng·L-1。DDT曾广泛应用于植物保护和公共卫生方面，主要以喷雾方式施用，土壤是DDT最主要的环境介质。调查显示，我国海河、长江和珠江流域水体及水体沉积物中DDT的污染较重，其中海河流域水体中DDT及其代谢物的平均浓度高达580 ng·L-1[2]。由于生物体具有富集作用，植物及人体中均可检测到DDT的存在，贵州省人体脂肪中DDT的含量达5 700 ng·g-1，北京和沈阳地区人体母乳中的DDT的残留量分别为180 ng·g-1和150 ng·g-1[3-4]。

双壳贝类对有机污染物具有较强的富集作用，是海洋环境污染的一种重要指示生物[5]。与脊椎动物的免疫系统相比，贝类不存在特异性免疫系统，其免疫系统仅有体液免疫以及细胞免疫。刘世良等[6]的研究表明，贝类的体液免疫主要通过血细胞中的水解酶类发挥作用，如酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、溶菌酶(LZM)等。在通常情况下，贝类的免疫功能在胁迫因子的存在下会受到严重的抑制。沈文英等[7]研究发现，铵态氮、亚硝酸盐氮胁迫三角帆蚌(Hyriopsiscumingii)后，其非特异性免疫酶(ACP、AKP、LZM)的敏感性高于血淋巴，高浓度有毒物质可使三角帆蚌的非特异性免疫酶活性下降。

污染物在贝类体内经代谢产生活性氧自由基，若不及时清除将导致生物体内活性氧失衡，导致氧化损伤[8]。而抗氧化防御系统能够在贝类受到污染物胁迫后清除活性氧自由基，该系统广泛存在于贝类体内，在这个过程中，抗氧化酶，如超氧化物岐化酶(superoxide dismutase，SOD)、还原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)、过氧化物酶(peroxidase，POD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GPx)等发挥重要作用[9]。研究发现，翡翠贻贝(Pernaviridis)在全氟辛烷磺酸(perfluorooctane sulfonate，PFOS)的胁迫下，2种组织的GPx和GSH活性均被明显诱导或抑制，丙二醛(malondialdehyde，MDA)的含量明显升高，表明抗氧化防御系统的变化反映了PFOS对翡翠贻贝的胁迫效应[10]。张先勇等[11]研究发现，在BaP胁迫下马氏珠母贝(Pinctadamartensi)的肝组织SOD酶活性表现出先受抑制后被诱导的变化规律。

翡翠贻贝是热带以及亚热带重要的环境指示物种，胚胎是海洋动物早期发育的一个重要阶段，对环境胁迫敏感。因此，研究其胚胎毒性对海洋环境保护、维持物种生物多样性具有重要的生态学意义[12]。本论文旨在通过研究BaP和DDT对翡翠贻贝胚胎抗氧化酶以及非特异性免疫酶的胁迫效应，评价其毒理效应，以期筛选出敏感生物标志物，为海洋环境污染早期预警以及海洋环境的生态风险评价提供科学依据。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 实验材料

成年翡翠贻贝取自海南陵水黎安港无污染海域，体长约为6.0～7.0 cm，通过镜检选取性腺发育良好的雌、雄各50只，用剪刀除去外壳上的足丝以及壳面的附着物，于水族箱中暂养3 d(温度为(25±2) ℃；盐度为32‰；pH为8.2±0.1)。之后，通过人工诱导受精的方式获得胚胎，于温度(281) ℃，盐度30‰1‰，pH为8.1±0.1的海水中培养胚胎。实验所用海水取自海南陵水黎安港无污染海域，经沙滤处理后备用。

1.2 主要试剂与仪器

苯并[a]芘(BaP)分析纯，购自美国Sigma公司；滴滴涕 (DDT) 分析纯，购自德国Dr公司；SOD测试盒、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)测试盒、ACP测试盒、AKP测试盒购自南京建成生物工程研究所；Multiskan FC酶标仪购自美国Thermo Fisher Scientific公司；PerkinElmer Lambda 25紫外分光光度计购自美国PerkinElmer公司；Eclipse E100体视显微镜购自日本Olympus公司；5810R冷冻高速离心机购自德国Eppendorf公司；SL-1800D超声细胞破碎仪购自南京顺流仪器有限公司。

1.3 实验方法

根据海区污染程度及相关参考文献来设置BaP和DDT的浓度[1, 13]，用适量DMSO溶解，配成储存液，实验时将母液稀释。设置2个处理组(25、50 μg·L-1)进行暴露实验，同时设置DMSO溶剂对照(0.005%)与海水空白对照组，每组浓度设置3个平行。通过人工受精技术获取胚胎，并在40倍显微镜下观察胚胎发育进程，待发育至D形期后，将翡翠贻贝胚胎转移到不同BaP和DDT浓度的海水中进行暴露试验。试验玻璃缸体积为20 L，海水水质参数为：温度(281) ℃，盐度30‰1‰，pH 8.1±0.1，分别于暴露24 h、48 h后用500目滤布过滤混匀后的海水收集贝苗，置于冻存管中，并放入无菌PBS，于液氮冷冻保存备用。

1.4 样品预处理

将样本混匀后用100目细胞筛过滤除杂，再用无菌PBS冲洗过500目细胞筛去除质量不高的胚胎。并在显微镜下调整胚胎的密度为20个·μL-1。随后将其放置于冰上并用超声细胞破碎仪破碎成组织匀浆液。按照试剂盒的说明立即用于测定SOD、GSH-Px、ACP、AKP酶的活性。

1.5 酶活力和蛋白含量测定

用于酶活测定的胚胎每个处理组约为1 200个，酶活性测定方法主要参照试剂盒说明书。采用考马斯亮蓝法进行蛋白含量的测定，以牛血清蛋白为标准蛋白。

1.6 数据的处理与分析

结果采用平均值±标准差的方法，用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析(One-way ANOVA),同时采用Duncan多重比较法分析各组间差异显著性(P< 0.05为差异显著)。综合生物标志物响应(IBR)指数的计算按照Pytharopoulou等[14]的方法，先对原始数据进行标准化处理，其次通过星状图呈现计算可用来衡量生物指标整合影响的可视化生物标志化结果，最后依照Oliveira等[15]介绍的方法计算RIB值。RIB值越大，表明生物所受影响越大。

2 结果(Results)

2.1 翡翠贻贝胚胎应答BaP和DDT胁迫的抗氧化酶研究

翡翠贻贝胚胎应答BaP和DDT胁迫的抗氧化酶活力响应如图1，结果表明BaP和DDT在不同浓度胁迫条件下，对翡翠贻贝胚胎的SOD和GPx活性均产生了显著影响(P< 0.05)。与对照组相比，用BaP和DDT暴露24 h后，随着浓度的升高SOD的活性受到明显的抑制，整体活性小于对照组，差异显著(P< 0.01)。暴露48 h后，SOD的活性表现为随着浓度的升高，酶活整体升高，50 μg·L-1处理组与25 μg·L-1相比，SOD酶活性差异不显著(P>0.01)。BaP和DDT胁迫48 h的SOD酶活比胁迫24 h的酶活大，且BaP处理后的SOD酶活比DDT大。而在BaP和DDT胁迫24 h后，GPx的酶活力随着浓度的升高也逐渐增大，且存在一定的剂量-效应关系(P< 0.05)。染毒48 h后，GPx的活性与SOD具有相似的规律，受到明显的诱导作用，且在50 μg·L-1达到最大值。

2.2 翡翠贻贝胚胎应答BaP和DDT胁迫的非特异性免疫酶研究

BaP和DDT胁迫翡翠贻贝胚胎后，其非特异性免疫酶(AKP、ACP)的活性影响见图2。翡翠贻贝胚胎在BaP和DDT染毒后ACP活力表现出规律不一致的变化，与对照组相比，DDT胁迫初期(24 h)，处理组浓度为25 μg·L-1时ACP的酶活性变化并不显著(P>0.05)，但50 μg·L-1时与对照组差异显著(P< 0.05)，处理组(25 μg·L-1和50 μg·L-1)之间没有显著性差异(P>0.05)，整体呈下降趋势。DDT胁迫48 h后，不同处理组之间进行比较差异不显著(P>0.05)。

在BaP胁迫初期(24 h)，浓度为25 μg·L-1的ACP酶活性差异显著(P<0.05)，处理组之间(25 μg·L-1和50 μg·L-1)没有显著性差异(P>0.05)，与DDT染毒后表现出相似的规律，整体也呈下降趋势。但在BaP染毒48 h后，其ACP的酶活力表现出先降低后升高的规律。就相同处理组而言，苯并芘和滴滴涕胁迫48 h的ACP酶活力比24 h的要高一些。此外，苯并芘和滴滴涕胁迫对翡翠贻贝胚胎的AKP活力影响规律基本一致，与对照组相比，胁迫处理对贻贝胚胎有显著影响(P<0.05)，胁迫24 h，BaP和DDT处理组的活性均下降，但下降幅度有差别，胁迫处理组25 μg·L-1和50 μg·L-1之间没有显著性差异(P>0.05)。与对照组相比，暴露48 h后BaP和DDT胁迫均诱导AKP的酶活性，随着暴露浓度的增加酶的活性有显著性差异(P<0.05)，存在明显的剂量-效应关系，在50 μg·L-1时其酶活性达到最大值。

图1 翡翠贻贝胚胎应答BaP和DDT胁迫的抗氧化酶活力响应注：柱形图上方字母表示Duncan多重比较法分析各组间差异显著性结果，各组间凡标有一个相同字母的即为差异不显著(P>0.05)，凡无相同字母的即为差异显著(P<0.05)。每组实验重复次数n = 3。Fig. 1 The responses of antioxidase activities in Perna viridis embryo under the exposure of BaP and DDTNote: The letters above the bar graph indicate the results of the difference significance test between the groups using Duncan's multiple comparison method. Each group that is marked with an identical letter means the difference is not significant (P>0.05), and with different letters means the difference is significant (P < 0.05). Each experiment was repeated 3 times.

图2 BaP和DDT对翡翠贻贝胚胎非特异性免疫酶影响注：柱形图上方字母表示Duncan多重比较法分析各组间差异显著性结果，各组间凡标有一个相同字母的即为差异不显著(P > 0.05)，凡无相同字母的即为差异显著(P<0.05)。每组实验重复次数n = 3。Fig. 2 The responses of immune enzyme in Perna viridis embryo under the exposure of BaP and DDTNote: The letters above the bar graph indicate the results of the difference significance test between the groups using Duncan's multiple comparison method. Each group that is marked with an identical letter means the difference is not significant (P>0.05), and with different letters means the difference is significant (P < 0.05). Each experiment was repeated 3 times.

2.3 整合生物标志物分析

在BaP和DDT胁迫下不同染毒时间点的翡翠贻贝胚胎的整合生物标志物分析结果见图3及图4。星状图中4个方向轴分别代表4种生物标志物(SOD、GPx、ACP、AKP)，RIB值即为图中根据4种酶的响应所构成的多边形面积。用BaP和DDT分别处理后，在不同的时间点(24 h和48 h)，高浓度(50 μg·L-1)和中浓度组(25 μg·L-1)翡翠贻贝胚胎4种抗氧化酶受到诱导或抑制；与对照组相比，浓度在50 μg·L-1和25 μg·L-1的星状图覆盖的面积较大。在相同时间点，BaP和DDT相比，DDT的RIB星状区域面积较大。

进行时间-效应分析(图5)，发现对照组在24 h和48 h的RIB值变化不明显。在中浓度和高浓度组的BaP和DDT胁迫24 h后，随着浓度升高RIB星状区域面积逐渐增大。在BaP和DDT胁迫48 h后，RIB星状区域面积呈现先升高后降低的趋势，但降幅不明显。就相同处理组而言，RIB在中浓度和高浓度组48 h的值明显小于24 h，且DDT的RIB值比BaP值大。

3 讨论(Discussion)

在动物整个生命周期中，早期胚胎对毒性物质最敏感，课题组的前期研究表明翡翠贻贝胚胎暴露于苯并芘36 h后，出现了壳缘内凹、绞合线内凹、不完全的壳、锯齿状的壳缘、凸出覆盖物等一系列畸形特征，并且随着暴露浓度的增加、暴露时间的延长，胚胎畸形率及死亡率也相应增大[13]。本研究试图从翡翠贻贝胚胎的抗氧化酶和非特异免疫系统角度探讨BaP和DDT的毒性作用，并寻找敏感的生物标志物。

图3 BaP胁迫下翡翠贻贝胚胎RIB星状图(左：24 h；右：48 h)Fig. 3 IBR of Perna viridis embryo under BaP exposure (left: 24 h; right: 48 h)

图4 DDT胁迫下翡翠贻贝胚胎RIB星状图(左：24 h；右：48 h)Fig. 4 IBR of Perna viridis embryo under DDT exposure (left: 24 h; right: 48 h)

图5 BaP和DDT胁迫下翡翠贻贝胚胎整合生物标志物响应指标(RIB)时间效应的变化Fig. 5 Temporal variation of R IB in Perna viridis embryo under the stress of BaP and DDT

贝类的免疫防御主要依靠体液免疫和细胞免疫，血清中的非特异性抗菌肽、溶菌酶等体液因子在免疫防御中发挥重要作用；其中溶菌酶活性、抗菌酶活性等都是衡量贝类免疫防御机能的重要指标[21]。而ACP和AKP广泛分布于动物组织中，是溶酶体中重要的体液因子，其中ACP在酸性环境中通过破坏表面带有磷酸酯的外源异物，可预防感染[22]。AKP在调节跨膜运输以及生物体DNA、RNA、蛋白质等大分子物质代谢起着重要作用[23]。有研究表明，无论是遭受机械损伤还是生存环境的恶化，都会使甲壳类动物的ACP、AKP活性发生变化，因此这2种酶活性的变化可以作为贝类养殖环境监测及病理变化的检测指标[24-25]。而海洋甲壳类动物胚胎受到有机污染物胁迫时，ACP和AKP活性会发生怎样的变化，这方面国内研究较少。在本实验中，与对照组相比，BaP和DDT胁迫24 h后，实验组胚胎的AKP活力均受到较大抑制，而在暴露48 h后，实验组AKP的酶活性恢复到了比对照组更高的水平，并且高浓度组活性比中浓度组更高。这似乎表明，BaP和DDT在24 h内严重影响了胚胎的免疫能力，而48 h后存活下来的胚胎，为了消除BaP和DDT对自己的影响，AKP活性极大升高以对抗有毒物质对胚胎的不利影响。有研究表明PFOS胁迫斑马鱼(Brachydaniorerio)一定时间后，斑马鱼头部的AKP活力变化呈现相似的规律[26]。此外，ACP活力对BaP和DDT的响应与AKP略有不同。在胁迫24 h后，实验组的ACP活力下降，其中BaP胁迫导致的ACP活力下降比DDT幅度更大；而48 h后，实验组ACP活力又恢复到接近对照组的水平。这表明，BaP和DDT在24 h内会对翡翠贻贝胚胎的ACP活性造成一定影响，但在48 h后其活性基本恢复正常。因此，相对于ACP活性，翡翠贻贝胚胎的AKP活性对于BaP和DDT的胁迫更为敏感。

由于各种酶在不同胁迫条件下表现出抑制或诱导效应，且响应不同步，不同酶的敏感程度有所差异，若仅仅考虑单一的酶活性，不能很好地定量评价其毒理效应，而整合生物标志物响应(Integrated Biomarker Responses，IBR)指数法可将不同生物指标的联合生物效应进行量化[14]，通过将几种酶或与其他生物标志物结合分析，能较准确客观地评估污染状况以及有效预测化学物质毒理效应差异[27]。目前，IBR指数法已广泛应用于海洋污染物的分布规律调查[28]及水生生物应对环境胁迫应激响应[29-30]。程凤莲等[31]利用IBR分析方法对春季北部湾潮间带多个站位污染情况进行评估，发现评估的污染程度与污染源种类及含量测定结果具有一致性，表明IBR指数法可应用于环境质量的综合评价。近期，王嘉慧等[32]采用IBR指数评价方法对芦苇(Phragmitesaustralis)中过氧化物酶(POD)、超氧化歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)等4种生物标志物进行整合分析发现：该评价方法可直接用于水体生态环境污染程度的风险评估。蒋玫等[33]利用IBR指数评价法考察了柴油污染环境中黑鲷(Sparusmacrocephlus)的肝脏、肌肉等组织中SOD、CAT和谷胱甘肽巯基转移酶(GST)活性随时间的变化规律，依据对应的IBR值对肝胰腺、鳃和肌肉3个组织的氧化应激能力进行了评估。在本实验中，我们采用IBR指数评价方法对翡翠贻贝胚胎中SOD、GPx、AKP、ACP这4种所选生物标志物进行整合分析，如图3及图4所示，星状图在浓度25 μg·L-1和50 μg·L-1时覆盖面积明显大于对照组面积，表明翡翠贻贝胚胎对BaP以及DDT胁迫产生了明显的应激响应。此外，无论是BaP还是DDT，实验组24 h的星状图面积都大于48 h的面积，这可能是由于胁迫24 h后各种酶活性对BaP和DDT胁迫开始响应，在48 h后，大部分酶活性已经逐渐恢复，RIB值出现一定幅度的降低。从RIB值随时间的变化(图5)分析，在相同实验浓度以及相同胁迫时间条件下，DDT的RIB值明显大于BaP，表明DDT对翡翠贻贝胚胎的毒性大于BaP，这一结论与其他学者的研究结果一致[34-35]。同时，该研究结果可为海洋环境污染控制以及相关标准的制订提供重要参考依据。