周鸿媛，唐莉莉，路勇，杨惠成，孙秀兰，王加生,#，钱和,*

1. 江南大学 食品学院/食品科学与技术国家重点实验室，无锡 214122 2. 江南大学 食品安全国际联合实验室，无锡 214122 3. 西南大学 食品科学学院，重庆 400716 4. 美国佐治亚大学 环境健康科学系，美国 佐治亚 雅典 30602 5. 中国食品药品检定研究院，北京 100050 6. 广州广电计量检测股份有限公司，广州 510630

粮食真菌毒素是一类存在于粮食中的真菌所产生的二级代谢产物。因其对生物体具有毒害作用且化学性质稳定、污染范围广泛，目前已成为威胁人类健康和环境安全的重要因素之一，受到广泛关注[1]。总体来说，黄曲霉毒素(aflatoxins, Afla)、单端孢霉烯族毒素类、玉米赤霉烯酮(zearalenone, ZEN)、伏马菌素(fumonisin, FUM)、赭曲霉毒素A(AspergiltusOchratoxin, OTA)和麦角生物碱类被认为是主要的生物毒素[2]。其中，黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1, AFB1)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol, DON)和玉米赤霉烯酮(ZEN)影响范围最广[3]，而DON在我国已成为污染量最大、污染范围最广的真菌毒素[4-5]。相关调查研究表明，全球范围内，越来越多的农产品被检出受到AFB1、DON和ZEN的单独或共同污染[3,6]。一份来自于Biomin公司的调查显示，在2010年中的3 300份送检样品(玉米、小麦、大麦、大米、大豆粉、玉米面筋粉、干酒糟和青贮饲料)中有78%样品呈阳性，即受到Afla、DON、ZEN、FUM和OTA不同程度的污染。在此批次样品中，同一样品中测出含有2种及以上毒素的送检样品的比率高达42%[3]。至2013年，毒素联合污染率仍居高不下(45%)[7]。由此可见，现实生活中食物可被多种真菌毒素污染，人类长期同时接触多种真菌毒素，可对健康造成与单一毒素作用不同的危害。因此，开展对食品中多种毒素联合毒性的评估，对指导食品安全、风险评估和公共健康等相关政策的制定以及未来研究发展方向具有极大的现实意义。

DON、AFB1和ZEN均为谷物及其制品中的常见污染物。研究表明，DON、AFB1和ZEN除对机体产生的各自最典型的毒作用(DON：拒食和细胞毒性；AFB1：三致作用；ZEN：类雌激素毒性)外，还存在一些交叉，如引起氧化应激、蛋白合成受阻，导致免疫失调、生殖毒性等[8-15]。由此可推测，3种毒素共存时在一定程度上会产生相互作用，从而对其毒性产生影响(增强或减弱)。目前，基于这一猜想，“联合毒性”这一概念已被提出，越来越多的学者对此展开了研究，但不同实验模型、实验剂量间的研究结果存在差异，对多种毒素间的联合毒性类型的评价也不相一致。Zhou等[16-17]研究表明，混合物AFB1+DON、DON+ZEN和AFB1+DON+ZEN均对HepG2人肝癌细胞(AFB1：0～5 μg·mg-1；DON：0～0.6 μg·mg-1；ZEN：0～11 μg·mg-1)和RAW 264.7鼠巨噬细胞(AFB1：0～3 μg·mg-1；DON：0～0.1 μg·mg-1；ZEN：0～12 μg·mg-1)产生协同/加和作用，混合物AFB1+ZEN则产生拮抗作用。而对BF-2蓝鳃太阳鱼细胞(AFB1：0～11.20 μmol·L-1；DON：0～16.20 μmol·L-1；ZEN：0～170.30 μmol·L-1)和野生型斑马鱼(AFB1：0～1.28 μmol·L-1；DON：0～135.00 μmol·L-1；ZEN：0～18.85 μmol·L-1)进行DON和ZEN联合暴露，则产生不同程度的拮抗作用，AFB1+ZEN却产生协同作用，而AFB1、DON和ZEN三者混合则随浓度的变化表现出不同的联合毒性类型。此外，Ji等[18]发现，DON(2 mg·kg-1)和ZEN(20 mg·kg-1)联合暴露对小鼠的肝脏代谢具有明显的拮抗作用。而Smith等[19]在研究DON(0.2 μmol·L-1)和ZEN(20 μmol·L-1)对人肝细胞HepaRG蛋白质组学时发现，在毒素暴露1 h后，蛋白质组分改变增多，而在暴露24 h后减少。由此可得，毒素的联合毒性类型及强弱与毒素组合、暴露时间、混合比例和实验模型密切相关。

秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans,C.elegans)(后文均简称为线虫)是一种可独立生活的非寄生虫类线虫，因其生命周期短、繁殖速度快、产卵量大、身体透明、培养方便且操作简单、成本低廉等优势，已被作为一种重要模式生物广泛应用于毒理学和生物学研究中[20-23]。此外，通过全基因组测序方法、光消融技术和激光显微技术破译线虫的全细胞系，并重建其神经系统，已得到了大量的有关线虫的生物学、遗传学和基因组学的数据[24-26]。此外，线虫有40%的基因已被证明与人类基因具有同源性，推断以线虫为模型的毒理学研究可在很大程度上反映人类对同种毒物所产生的毒理反应[27]。目前，已有学者将线虫作为人体健康与生态毒性的双重模式动物，研究环境中重金属或/和农药残留单一或联合暴露对机体的毒害作用，并逐步建立起了相对完整的研究体系[27-28]，但对粮食真菌毒素的毒性研究，鲜有报道。因此，本研究首次以线虫为模型，对DON、AFB1和ZEN及其联合毒性进行评估，模拟毒素在现实生活中的存在模式，以国标限量标准为基础设定实验暴露剂量，旨在为今后相关标准的制定提供科学依据，进而指导人体健康效应判断与生态风险评估。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 试剂与线虫品系

DON、AFB1和ZEN均购于Sigma-Aldrich公司(美国)，纯度均≥98%。先将DON、AFB1和ZEN粉末分别溶于超纯水、二甲基亚砜(DMSO，购于美国Sigma-Aldrich公司，纯度≥99.9%)和无水乙醇(购于美国Sigma-Aldrich公司，纯度≥99.9%)，制备成浓度为10 mg·mL-1的储备液并避光存于-20 ℃。实验时，用K-medium(2.36 g KCl, 3.00 g NaCl, 1 000 mL dH2O)稀释成工作液，进行实验。

野生型Bristol品系线虫(N2)和大肠杆菌菌株(OP50)均购于国际线虫遗传中心(CaenorhabditisGenetics Center/CGC)。所有实验用线虫均为雌雄同体型。以线虫标准培养方法[29]为依据，将线虫培养于以OP50作为食物源的固体线虫生长培养基(NGM)上，其配制方法参照Brenner法[30]。选用L-broth[23]液体培养基对OP50进行培养，作为线虫暴露实验的食物源。所有线虫培养均在20 ℃条件下进行。

1.2 实验方法

1.2.1 线虫准备

首先，向装有孕期成虫和及其虫卵的NGM中加入适量K-medium，用L型玻璃涂布棒将其从NGM上刮下并收集到15 mL离心管中，3 000 r·min-1离心7 min，弃上清。然后，向沉淀中加入7 mL裂解液(8 mol·mL-1NaOH∶NaClO = 5∶1,V/V)[31]，静置7 min，再3 000 r·min-1离心7 min，弃上清。随后，加入12 mL K-medium轻轻混匀后3 000 r·min-1离心7 min，弃上清，重复此操作一次。最后，将沉淀接种到NGM上培养(20 ℃)。实验所用线虫均为雌雄同体型。

1.2.2 线虫生长发育测定

通过测定线虫的身长(头部-尾末)来衡量线虫的生长发育情况。将同步化(L1/L2)的N2幼虫从培养板中转移到含有1 mL/孔特定毒素浓度和充足食物的12孔培养板中。每孔大约含有30～50条L1/L2期的线虫，并放在belly button®振动器上低速摇晃，20 ℃。分别在24 h和48 h，用K-medium润洗线虫2次，再用10%福尔马林固定。5 min后，将线虫转移到玻璃皿上，在连有数码相机和Image-Pro®Express软件程序的显微镜(Olympus SZX9)下观察拍照。对照组和各剂量实验组均不少于20只线虫，3组平行试验。

1.2.3 线虫生殖能力测定

线虫生殖能力通过后代数目来评价。本实验参照Dhawan 72小时法[31]，改良后简述如下：将同步化(L1/L2)的N2幼虫转移到含有充足食物源的新NGM上，20 ℃培养直到L4末期。然后，挑出一只L4末期的线虫放入装有特定浓度毒素和充足食物(1 mL/孔)的12孔板中，放在振动器上低速摇晃，20 ℃培养72 h，各浓度3次平行试验。72 h后，在显微镜下记录每孔里所有阶段的线虫数(不含虫卵)。

1.2.4 毒素联合毒性的Chou-Talalay评价方法

本实验采用Chou-Talalay法评价多种毒素共同存在时的联合毒性类型[32]。该方法是基于中效原理和等效线原理，能可视化评估待测混合物中不同毒素间的相互作用。该计算模型要求混合物中各组分按固定比率混合，本实验混合比率为：AFB1∶DON∶ZEN = 1∶40∶5。在等辐射分析中，相互作用指数(CI)常在酶、细胞和动物体系中作为确定作用类型的指标[32-33]。CI值可通过下列公式计算：

表1 联合毒性分类标准及其相应符号Table 1 Descriptions and symbols of the degrees of combined toxicity grading

注： 联合毒性的等级分类及其相应的符号均依据Chou所建立的理论[32]。Note: The degrees of combined toxicity and corresponding symbols were according to the theory build by Chou[32].

1.2.5 统计学分析

原始数据有Excel进行分析处理，所有实验结果均用平均数±标准差表示，图表中的结果均以对照组的百分比(%)表示。EC50由SPSS 21统计软件中Probit回归函数拟合得出，联合毒性类型由Chou-Talalay方法进行评价得出。采用t-test法评价实验组与对照组是否存在显著性差异，one-way ANOVA法及Bonferroni检测(SPSS 21)对实验数据进行组间比较和差异显著性检验(P< 0.05、P< 0.01、P< 0.001)。

2 结果(Results)

2.1 AFB1、DON和ZEN均对线虫的生长发育和生殖能力产生剂量-效应毒性

我国食品中真菌毒素限量标准GB2761—2011规定：谷物及其制品中，AFB1、DON和ZEN的限量需分别≤ 20、1 000、60 μg·kg-1。鉴于物种差异和不同暴露类型等因素存在，为获得更能反映现实生活中的暴露水平，在实验设计时通常需考虑不确定/安全系数(100～1 000倍)[34]。因此，本实验选用：20 mg·L-1AFB1、800 mg·L-1DON和100 mg·L-1ZEN(预实验时发现ZEN浓度为60 mg·L-1时对线虫体长作用效果不理想)作为高剂量组(不确定系数=1 000)；10 mg·L-1AFB1、400 mg·L-1DON和50 mg·L-1ZEN作为中剂量组(1/2高剂量组浓度)；2 mg·L-1AFB1、80 mg·L-1DON和10 mg·L-1ZEN作为中剂量组(1/10高剂量组浓度)。分别对线虫进行染毒，并在24 h和48 h测定线虫体长的变化量，72 h测定线虫的产卵量。AFB1、DON和ZEN对线虫生长发育和生殖能力的半数效应浓度(EC50)见表2。结果显示，AFB1随着暴露时间的增长，毒素对生长发育的抑制作用随之增强(EC50-24 h =9.49 mg·L-1> EC50-48 h =5.10 mg·L-1)，DON则与之相反(EC50-24 h =476.42 mg·L-1< EC50-48 h =1 309.38 mg·L-1)，而ZEN并无明显变化(EC50-24 h =56.69 mg·L-1≈ EC50-48 h =55.31 mg·L-1)。此外，各暴露组均与其对应的对照组存在显著性差异，且随着AFB1、DON和ZEN暴露剂量的增加，对线虫的生长发育和生殖能力的抑制作用呈显著的剂量-效应正相关性(图1)。

2.2 AFB1、DON和ZEN对线虫的联合毒性类型由毒素的组合及暴露剂量共同决定

由图1可见，各模型组均随着暴露剂量的增加，毒作用也相应增强，存在显著的剂量-效应关系。其中，AFB1+DON和AFB1+ZEN分别与AFB1、DON和ZEN的单一暴露相比，对线虫生长及其产卵量的抑制作用明显增强，而DON+ZEN则出现毒性显著性减弱的趋势。AFB1+DON+ZEN则因暴露剂量的不同，仅在暴露24 h时对线虫体长存在显著性毒性增强作用，而在48 h时低、高浓度时，与AFB1单一暴露结果相似；对线虫繁殖能力仅与DON和高浓度ZEN单一暴露时存在显著性毒性增强。对此，为了能客观定义混合物的联合毒性类别，本实验采用Chou-Talalay模型及其相应程序进行评价(表3～5)。

图1 AFB1、DON和ZEN单一及联合暴露下对线虫生长发育和生殖能力的毒性作用注：体长比率由暴露组线虫产卵数与对照组线虫产卵数比较而得。横坐标中，A、D、Z、AD、AZ、DZ、ADZ分别代表AFB1、DON、ZEN、AFB1+DON、AFB1+ZEN、DON+ZEN和AFB1+DON+ZEN；AFB1、DON和ZEN在低/中/高剂量组中浓度分别为2/10/20、80/400/800和10/50/100 mg·L-1。所有暴露组与其对应的对照组相比，均有显著性差异，鉴于作图方便，未在图中标注，在此说明。** P < 0.01，*** P < 0.001(AFB1单独暴露与其联合暴露组相比)；# # P < 0.01，# # # P < 0.001(DON单独暴露与其联合暴露组相比)；Δ Δ P < 0.01，Δ Δ Δ P < 0.001(ZEN单独暴露与其联合暴露组相比)。Fig. 1 Toxic effects of AFB1, DON and ZEN alone and their binary or tertiary mixtures on development and reproduction of C. elegansNote: The body length rate is obtained by the body length in treated group compared to control group. A, D, Z, AD, AZ, DZ, ADZ are the abbreviations of AFB1, DON, ZEN, AFB1+DON, AFB1+ZEN, DON+ZEN and AFB1+DON+ZEN, respectively. The lower/intermediate/higher doses of AFB1, DON and ZEN are 2/10/20, 80/400/800 and 10/50/100 mg·L-1. All mycotoxin-exposed groups are significantly different from its corresponding control groups, which are not shown in the figure due to the convenience of making clear and concise figures. ** P < 0.01, *** P < 0.001 (group of AFB1alone compared with its corresponding combined group); # # P < 0.01, # # # P < 0.001 (group of DON alone compared with its corresponding combined group); Δ Δ P < 0.01, Δ Δ Δ P < 0.001 (group of ZEN alone compared with its corresponding combined group).

表2 黄曲霉毒素B1(AFB1)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)和玉米赤霉烯酮(ZEN)单一暴露下线虫生长发育和生殖能力的EC50及其置信区间(95%)Table 2 EC50 with 95% confidence interval (CI) of aflatoxin B1(AFB1), deoxynivalenol (DON) and zearalenone (ZEN) alone on development and reproduction of C. elegans

注：由于最高剂量的DON仍不能引起超过50%的抑制作用，a表示数字均由拟合曲线估算得出，故存在较大偏差。Note: Because the inhibitory effects forC.eleganstreated with the highest concentration of DON are still lower than 50%,athe numbers are obtained by the fitting curve, and hence there is a large deviation.

表3 AFB1、DON和ZEN对线虫生长(24 h)的联合毒性作用Table 3 Combined toxic effect of AFB1, DON and ZEN on the growth (24 h) of C. elegans

注：联合毒性的分级参见前文。Dm和m值被用来计算CI值，其对应毒素混合物相互作用类型可参见表1。Dm、m和r分别代表中效计量、动力学顺序和拟合函数的回归系数；EC25、EC50和EC75值是指对体长产生25%、50%和75%抑制作用时的剂量。在本实验设计中，混合物中AFB1-DON-ZEN的比率均为1:40:5。本评估模型采用基于Chou-Talalay方法的CalcuSyn软件。Note: The degrees of combined toxicity were graded as previously reported.Dmandmvalues are used for calculating the CI value which can be referred to Table 1 for the corresponding types of interactions. Here,Dm,mandrstand for median-effect dose, kinetic order and regression coefficient of the fitting function, and EC25, EC50and EC75values are the doses required to inhibit body length by the rate of 25%, 50% and 75% of the whole system. The ratio of AFB1-DON-ZEN is 1:40:5 used for the experimental design. CalcuSyn software based on the Chou-Talalay method was used for this assessment.

表4 AFB1、DON和ZEN对线虫生长(48 h)的联合毒性作用Table 4 Combined toxic effect of AFB1, DON and ZEN on the growth (48 h) of C. elegans

注：联合毒性的分级参见前文。Dm和m值被用来计算CI值，其对应毒素混合物相互作用类型可参见表1。Dm、m和r分别代表中效计量、动力学顺序和拟合函数的回归系数；EC25、EC50和EC75值是指对体长产生25%、50%和75%抑制作用时的剂量。在本实验设计中，混合物中AFB1-DON-ZEN的比率均为1:40:5。本评估模型采用基于Chou-Talalay方法的CalcuSyn软件。由于最高剂量的DON仍不能引起超过50%的抑制作用，a数字为拟合曲线估算得出，故存在较大偏差。Note: The degrees of combined toxicity were graded as previously reported.Dmandmvalues are used for calculating the CI value which can be referred to Table 1 for the corresponding types of interactions. Here,Dm,mandrstand for median-effect dose, kinetic order and regression coefficient of the fitting function, and EC25, EC50and EC75values are the doses required to inhibit body length by the rate of 25%, 50% and 75% of the whole system. The ratio of AFB1-DON-ZEN is 1:40:5 used for the experimental design. CalcuSyn software based on the Chou-Talalay method was used for this assessment. Because the inhibitory effects forC.eleganstreated with the highest concentration of DON are still lower than 50%,athe numbers are obtained by the fitting curve, and hence there is a large deviation.

从表3和表4可知，在低剂量(EC25)短时间(24 h)内，混合物AFB1+DON对线虫的生长发育表现出加和作用，随着暴露浓度(EC50/EC75)的增加和/或暴露时间(48 h)的延长，AFB1+DON则对线虫表现出协同作用。但在本实验中，混合物DON+ZEN对线虫均表现出拮抗作用，且随着暴露浓度和暴露时间的增加，拮抗作用增强。另外，混合物AFB1+ZEN在24 h时，对线虫的联合毒性类型在EC25、EC50和EC75时分别为弱拮抗作用、近似加和作用和弱协同作用，但在48 h时，则由一般协同作用(EC25)变为弱协同作用(EC50、EC75)。最后，混合物AFB1+DON+ZEN对线虫的生长发育除在EC50-24 h和EC75-24 h表现出毒性增强外，其他均为(极弱-弱-一般)拮抗作用。

表5列出了真菌毒素混合物对线虫繁殖能力的联合毒性类型。其中，混合物AFB1+DON在EC25暴露时表现为加和作用，随着浓度的增加，则变为弱协同作用。混合物AFB1+ZEN则由弱拮抗作用(EC25)变为极弱协同作用(EC50)再到一般协同作用(EC75)。相反地，混合物DON+ZEN和混合物AFB1+DON+ZEN则对线虫的繁殖能力分表变现强拮抗作用和一般拮抗作用。

3 讨论(Discussion)

本实验旨在评价3种最为常见的真菌毒素(DON、AFB1和ZEN)共同存在时的联合毒性及其毒作用类型。研究表明，单独作用时，AFB1对线虫的毒性作用最强，DON最弱。此外，采用Chou-Talalay模型分析毒素混合物对线虫的毒性作用情况，得到混合物中毒素间的相互作用类型。混合物AFB1+DON和混合物DON+ZEN较为一致地分别表现出加和/协同作用和拮抗作用。而混合物AFB1+ZEN和混合物AFB1+DON+ZEN则会因暴露浓度、暴露时间和检测指标的不同，表现出不同的联合毒性类型。

由表2可知，AFB1分别在5.10(95%CI = 2.17～8.30)和2.32(1.57～4.09) mg·L-1时对线虫的体长-48 h和产卵数造成50%的抑制作用。现已有报道表明，在4 218份农产品样本中，AFB1的检出最大值可高达1 563 μg·kg-1 [7]，这表明真菌毒素在环境中的高暴露风险对人体健康安全存在着潜在威胁，同时为评价联合毒性强弱的剂量设定提供了理论依据，为加强开展联合毒性风险暴露评估提出了现实要求。此外，实验结果还表明，随着暴露时间的增加，AFB1对线虫的生长抑制作用增强，而DON呈减弱趋势，ZEN则维持不变。这一现象可能与不同毒素在线虫体内的毒性动力学和生物转化关系密切。因此，暴露时间可作为另一显著影响因素，同暴露剂量一起影响目标毒素对线虫的毒性作用，即具有剂量-时间-效应关系。

联合毒性实验结果表明，混合物AFB1+DON对线虫表现出毒性增强，即协同作用和加和作用(仅在EC25时对24 h-体长和产卵数)。该结果与已有报道(细胞模型、斑马鱼和小鼠模型)基本一致[16-17,35-36]。

表5 AFB1、DON和ZEN对线虫产卵数的联合毒性作用Table 5 Combined toxic effect of AFB1, DON and ZEN on the brood size of C. elegans

注：联合毒性的分级参见前文。Dm和m值被用来计算CI值，其对应毒素混合物相互作用类型可参见表1。Dm、m和r分别代表中效计量、动力学顺序和拟合函数的回归系数；EC25、EC50和EC75值是指对产卵数产生25%、50%和75%抑制作用时的剂量。在本实验设计中，混合物中AFB1-DON-ZEN的比率均为1:40:5。本评估模型采用基于Chou-Talalay方法的CalcuSyn软件。Note: The degrees of combined toxicity were graded as previously reported.Dmandmvalues are used for calculating the CI value which can be referred to Table 1 for the corresponding types of interactions. Here,Dm,mandrstand for median-effect dose, kinetic order and regression coefficient of the fitting function, and EC25, EC50and EC75values are the doses required to inhibit brood size by the rate of 25%, 50% and 75% of the whole system. The ratio of AFB1-DON-ZEN is 1:40:5 used for the experimental design. CalcuSyn software based on the Chou-Talalay method was used for this assessment.

这可能是由于AFB1的代谢产物与DNA结合，引起p53基因改变，对蛋白合成造成影响[37-38]。同时，DON作为RNA、DNA和蛋白合成的潜在抑制因子，可进入细胞与核糖体60S亚基结合，干扰肽基转移酶的活性，也抑制蛋白质的合成[39]。因此，DON和AFB1共同存在时，增加了各自原有的毒性，使联合毒性明显增强。由此表明，毒素混合物可通过共同和/或不同的通路进行相互作用，从而改变毒性强弱。然而，混合物AFB1+ZEN则因暴露浓度和时间的不同，表现出不同的联合毒性类型。例如，AFB1+ZEN在EC25时，对体长(24 h)和产卵量均产生拮抗作用，而随着暴露剂量的增加(EC50和EC75)，则产生加和作用或协同作用。而在48 h时，则均产生协同作用。这可能源于共存的毒素改变了原有毒代动力学和/或生物转化。Gillesby和Zacharewski[40]曾报道，ZEN可通过与之相结合的受体与AFB1功能团上的呋喃相互作用，暗示ZEN可阻碍AFB1与其靶位点结合，从而使毒性减弱。相反，混合物DON+ZEN则变现为拮抗作用，这一结果与成年猪模型结果相反[41]，但与斑马鱼模型中结论一致[17]。此外，混合物AFB1+DON+ZEN对线虫的生长发育在24 h暴露时，由弱拮抗作用(EC25)变为加和作用(EC50)再变为一般加和作用(EC75)，而在48 h暴露时，则由极弱拮抗作用逐步变为一般拮抗成作用；对线虫的繁殖能力则毒性强弱较为稳定。这一现象可推测是因受到3种毒素在不同浓度和时间的共同作用和综合影响，以及检测指标的不同，导致其联合作用类型较为复杂。因此，对多种毒素间的相互作用及机理仍有待进一步深入研究，这不仅有助于丰富毒素领域的研究广度和深度，更对今后相关政策的制定以及有关公共卫生的决策具有科学的指导作用。