王晓科，石清清，邓代莉，蒲生彦,3,

1. 地质灾害防治与地质环境保护国家重点实验室(成都理工大学)，成都 610059 2. 国家环境保护水土污染协同控制与联合修复重点实验室，成都 610059 3. 香港理工大学土木及环境工程学系，香港

随着纳米科技的快速发展，越来越多的纳米材料进入到环境中，产生环境及生物体健康风险[1]。纳米材料的潜在生物毒性，已经成为全世界科学界、环保主义者、社会学家、伦理学家所关注的重大安全问题。2003年4月，美国学者首先研究了碳纳米管的生物效应[2]。2004年1月，Masciangioli等[3]在肯定了纳米技术带给人类生活便利的同时，也强调必须关注纳米技术的安全性研究。随后，越来越多的科学家及学者加入到了研究纳米材料生物毒理的行列中。研究纳米材料对生物、人体健康和环境的负面影响，对保证纳米技术的可持续发展，不断造福人类有重要意义。

由于土壤作为纳米材料释放到环境中主要的汇，研究纳米材料对土壤生物的毒性作用也成为关注热点[4]。研究纳米材料的生物毒性需要选择适合的模式生物，由于土壤生物种类众多，选择具有代表性的生物十分必要，而理想的模式生物又能为科研节约时间和经济成本[5]。模式生物的选择需要注意以下几点：(1)在分类学、营养水平及生理特征上具有代表性；(2)易于实验室培养繁殖和大量获取；(3)生理学、营养学、遗传学和生态学背景资料丰富；(4)对毒物具有敏感性，测试终点清晰且易于试验操作[6-7]。当前用于纳米材料生物毒性研究的典型土壤模式生物主要有秀丽隐杆线虫[8]、蚯蚓[9-11]、跳虫[12-14]和潮虫[15]，都具有生理特征代表性、便于获取与操作、繁殖周期短等普遍模式生物特性。

本文通过大量的文献调研，较系统地归纳总结了基于几种典型土壤模式生物的纳米材料毒理研究现状与进展，提供了土壤模式生物的特性对比选择，梳理了纳米材料生物毒性机理，并对未来研究方向及重点做了进一步的展望。

1 基于秀丽隐杆线虫的纳米材料毒理研究(Toxicology of nanomaterials to Caenorhabditis elegans)

秀丽隐杆线虫(C.elegans)，简称秀丽线虫，是一种被广泛用于生态毒理学和生物毒性测试的模式生物[5]，一般为雌雄同体，是在土壤中数量丰富的多细胞生物，具有结构简单、小而透明、生命周期短、对环境变化敏感、行为反应模式稳定、遗传背景清楚及指标体系多样等特点[16-18]。早在1965年，Sydney Brenner博士就开始培养线虫作为模式生物。2002年，美国材料与试验协会颁布了秀丽线虫用于土壤毒性评价的标准化指南，这肯定了线虫可作为评价土壤生物毒性的模式生物[19]。

秀丽线虫的评价指标体系分为个体(动物)水平和细胞(分子)水平[5]。个体水平的指标主要有致死率、生长发育、生殖、寿命、运动及摄食等[20]。细胞水平的评价指标主要包括氧化应激、基因表达、蛋白质表达、DNA损伤、RNA干扰、细胞凋亡及细胞周期停滞等[21-22]。

工程中常用的纳米材料主要分3种：碳基纳米材料、量子点纳米材料、金属及金属氧化物纳米材料。表1梳理并总结了不同纳米材料对秀丽线虫的毒性影响。

在探索毒性机理的过程中，不同研究可能得到不完全一致的结论，可能存在某些影响毒性结果的因素，如土壤的物理化学特征(如粒度分布和有机物质)[37]及暴露环境等。有研究发现氧化石墨烯(GO)通过DNA损伤诱导生殖细胞凋亡和细胞周期阻滞，损伤性腺发育进而导致秀丽线虫生殖能力降低[27]。GO引起秀丽线虫体内ROS产生，是造成靶器官损伤的主要原因[26]。此外，某些信号通路在控制GO对生物体毒性过程中也起着关键作用，如神经元ERK[38]和肠道p38 MAPK介导的信号传导途径[39]协同作用调节对GO暴露的响应；Wnt配体基因的功能丧失突变调节GO毒性和易位[40]；抗菌蛋白在胰岛素信号通路和肠道中起作用以调节对GO的响应[41]；Long noncoding RNAs通过调节生物学过程和信号传导途径来影响GO毒性[42]。有研究表明，存在反馈机制来加强MicroRNA let-7抑制保护线虫免受多壁碳纳米管(MWCNT)毒性的作用[43]。

有研究表明CdTe QDs对秀丽线虫的毒性不仅源于Cd2+的释放，还与NPs在肠道中[30]及其胞内分布有关[44]。除了氧化应激，细胞识别也影响CdTe QDs在线虫中的神经毒性[45]。编码Mn-SOD的基因的过表达有效地抑制了CdTe QDs对受体介导(RME)运动神经元的发育和功能的神经毒性作用。据相关研究显示，CdTe QDs的氧化应激、神经元细胞识别和生物利用度共同作用，影响了RMEs运动神经元中CdTe QDs的神经毒性[29]。

现在较为公认的纳米金属及氧化物材料毒性机理有ROS的产生[35]、金属离子的释放[46]、DNA损伤与线粒体毒性[47]等。ROS产生与致死率、生长、繁殖、运动行为和肠道自身荧光显著相关，有证据表明ROS通过控制氧化应激所需基因的表达水平变化，在诱导NPs毒性效应中发挥重要作用[35]。Luo等[48]发现Ag NPs通过引起氧化应激增加、线粒体毒性和DNA损伤，诱导细胞凋亡，进而对秀丽线虫产生影响。另外，热休克蛋白、金属硫蛋白(MT)、内吞作用以及细胞凋亡信号等信号通路也是纳米材料造成生物毒性的机制[49]。但是考虑到土壤基质的复杂性和可用数据的缺乏，更精确的生物毒性机理目前科学界还不能轻易下定论，需要更全面深入的研究。

2 基于蚯蚓的纳米材料毒理研究(Toxicology of nanomaterials to earthworms)

蚯蚓是陆地生态系统中最常见的无脊椎土壤动物，其生物量占土壤动物总量的60%～80%，在土壤生态系统中具有重要的作用。蚯蚓有较强的环境适应能力、对污染物敏感、体型较大、方便检测体内粒子分布、培养方便、操作简单等特点[50]，被广泛应用于污染物生物毒性测试和土壤污染风险评估，被认为是理想的土壤污染指示生物[9]。蚯蚓生态毒性测试的标准方法已经由国际标准化联合会(International Organization for Standardization, ISO)制定，实验室开展蚯蚓生物富集研究的标准草案也已经由美国测试与材料学会发布[10]。

纳米材料对蚯蚓的毒性研究主要从3个层次展开：种群水平、个体水平、微观水平[11]。个体水平研究包括食物富集作用、存活及行为反应、发育繁殖效应。目前常用的蚯蚓微观评价指标有：DNA的损伤、酶活性、金属硫蛋白和氧化应激水平等[51]。表2梳理并总结了不同纳米材料对蚯蚓的毒性影响。

纳米材料对蚯蚓的毒性机理包括影响酶活性[57]、诱导ROS产生[60]、DNA损伤[60]、消耗能量储备[61]等。不同测试指标的敏感度也不尽相同，有研究表明，蚯蚓对污染物的回避行为可能比更成熟的生物参数(如死亡率、生长或繁殖)更敏感[60]，具有反应快速、灵敏度高和重现性良好等特点。利用蚯蚓回避行为评价土壤环境质量的标准化试验方法(ISO，2005)的发布，表示蚯蚓作为模式生物在污染土壤生态评价方面具有广阔前景[52]。

3 基于其他模式生物的纳米材料毒理研究(Toxicology of nanomaterials to other model creature)

3.1 跳虫

跳虫(springtails或Collembolans)又称弹尾虫、腹管虫、粘管虫等，是弹尾纲动物的俗称,是分布广泛的一种无脊椎节肢动物，生活在潮湿的土壤环境中，其种类丰富，数量众多，在土壤生态系统中扮演了重要角色[12]。常用的跳虫主要有Folsomiacandida和Orchesellacincta等，其中跳虫Folsomiacandida应用最广泛，它生长周期短，易于实验室人工饲养，对土壤污染较为敏感。Folsomiacandida生态毒性测试方法(ISO，1999)为应用跳虫对污染土壤进行生态毒性评价提供了基础依据[62]。

Tourinho等[63]研究发现CeO2NPs对Folsomiacandida的存活和繁殖没有不利影响。在高浓度6 400 mg·kg-1下，ZnO NPs不影响跳虫的存活、繁殖，而低浓度时有轻微影响，30 nm和200 nm ZnO的毒性几乎没有差异[64]，说明粒径大小并没有明显影响生物毒性。由ZnO NPs释放的锌离子可能是影响毒性大小的主要因素。ZnO NPs对生殖的影响随着pH的增加而降低，EC50值随着pH值的增加而增加[64]。跳虫暴露在浓度高达673 mg·kg-1的Ag NPs下28 d后时仍然没有观察到跳虫的生存和繁殖异常，但是溶解的银离子会被跳虫吸收而造成一定影响[65]。纳米银的潜在毒性是否由释放的游离银离子引起，还需要更多的研究。

3.2 潮虫

潮虫(Porcellio)俗称鼠妇、木虱或西瓜虫等，属于甲壳动物亚门软甲纲等足目潮虫亚目，是唯一能完全适应陆地生活的等足类动物，其分布广泛，主要活动于地表凋落物层中，是土壤有机体的重要分解者。其数量巨大，种类繁多，对环境敏感性好，也被用于评价污染土壤的毒性测试[15]。

Novak等[66]通过常规的毒性测试如摄食率、体重等，评估摄入浓度为1 000、2 000 mg·kg-1纳米TiO2对潮虫的短期(3 d和7 d)和长期(14 d和28 d)变化和死亡率的影响。在饮食暴露于纳米TiO23、7、14或28 d没有观察到严重的毒性作用，即没有死亡，体重无明显变化。Drobne等[67]也发现在1 000 mg·kg-1和3 000 mg·kg-1纳米TiO2暴露时，潮虫的存活率、摄食率和体重没有变化。但是在微观指标方面却有不一样的发现，Jemec等[68]研究发现摄食纳米TiO2对潮虫消化腺体中过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽-S-转移酶(GST)等抗氧化酶的活性以剂量依赖性方式影响，高浓度和低浓度时CAT和GST活性有所降低，但是中等浓度(1～1 000 mg·kg-1)时没有导致酶活性的显著变化。暴露于较低浓度纳米颗粒的潮虫，其消化细胞膜严重不稳定。研究表明细胞膜强烈的不稳定性是零星存在的[64]，需要进一步的研究来证实纳米颗粒的这种零星的毒性效应。

4 结语与展望(Conclusion and prospect)

目前基于土壤模式生物的纳米毒理研究还处于起步阶段，理论基础比较缺乏，研究数据也不全面，研究的深度和广度都有待提高。近年来的研究有从单一污染物向复合污染物，静态研究向动态研究转变的趋势，但是也多侧重于直接毒性，而对于土壤中生物物种之间的相互作用关注较少，因此在种群或群落水平研究有很大差距。依据模式生物选择原则，重点考虑生命周期、暴露方式和毒理学意义，不断完善土壤模式生物体系，对评估纳米毒性和探究纳米毒性机理至关重要，也对建立相关的环境基准有重要意义。而由于生物多样性和地理分布差异，不同地区的物种敏感度分布也存在差异，因此，对于不同国家建立本土物种的毒性测试数据库也十分必要。秀丽线虫、蚯蚓和跳虫等是目前纳米毒理学研究中应用最多的模式生物，与此同时，其他良好的模式生物也要加快探索，以便更全面、准确地评价纳米生物毒性和探索毒性机理。

随着纳米材料生物毒理的逐步研究深入，其对土壤模式生物的研究应在以下几个方面加以发展和完善：(1)依据模式生物选择原则进一步筛选合适的理想模式生物；(2)建立标准化的实验方法，建立并完善统一的在线共享数据库；(3)深入探索从个体水平、细胞水平到分子水平的毒性机理，应用基因技术和蛋白质技术探索深层次毒性机理；(4)将体内和体外研究结合起来，重点关注生物种群间相互作用，探索纳米材料对微生物群落的结构和功能的影响；(5)开展对影响纳米材料生物毒性的有关因素的研究，重点研究土壤性质在纳米材料对模式生物毒性中的作用。