季晓微， 王 琳， 徐 军， 刘素英， 董 曦

复旦大学附属中山医院生殖医学中心，上海 200032

卵巢癌已成为目前威胁女性健康的常见恶性肿瘤之一。卵巢癌早期发病隐匿，缺乏特异性高的诊断技术，超过70%的患者在确诊时已处于晚期；并且其侵袭速度快、复发率高，患者的5年生存率低于30%[1]。因此，探索特异性强、灵敏度高的诊疗靶点成为目前亟待解决的热点问题。

MicroRNA(miRNA)是一类具有调控靶基因转录水平的内源性小分子非编码RNA，能通过与靶基因mRNA的3′非翻译区特异性结合，抑制mRNA的转录水平，实现对功能基因表达的调控，从而参与多种肿瘤细胞增殖和侵袭等恶性生物学行为的调控[2]。研究证实，miRNA-29b是一种能够发挥抑癌作用的microRNA分子。目前已经在多种恶性肿瘤中发现miRNA-29b的表达异常下降，包括肺癌、乳腺癌、胰腺癌、黑素瘤等多种肿瘤[3-4]。因此，本研究拟观察miRNA-29b对人卵巢癌细胞增殖的调控作用及其分子机制，旨在为卵巢癌的早期诊断和靶向治疗提供潜在的靶点。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器 人卵巢癌上皮细胞系SKOV-3及人正常卵巢上皮细胞系IOSE80购自美国ATCC细胞库；细胞培养试剂(DMEM培养基、胎牛血清、链霉素青霉素、胰蛋白酶)购自美国Gibco公司；细胞增殖活性检测试剂盒Cell Counting Kit-8购自日本同仁化学研究所；ECL化学发光试剂和BCA蛋白浓度检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；miRNA提取试剂盒、miRNA反转录和荧光定量试剂盒、LipofectamineTM2000转染试剂盒均购自美国Invitrogen公司；miRNA-29b mimic、mimic control miRNA由上海吉玛制药技术有限公司合成，miRNA-29b和U6引物由生工生物工程(上海)股份有限公司设计合成，其他常用生化试剂购自美国Sigma公司。

1.2 细胞培养 人卵巢癌上皮细胞系SKOV-3及人正常卵巢上皮细胞系IOSE80复苏后，使用含10%胎牛血清和1%双抗的DMEM培养基进行培养，恒温细胞培养箱条件为37℃、5% CO2，每天更换1次培养基，细胞融合度>80%进行消化、传代和接种，用于后续研究。

1.3 miRNA-29b表达水平的检测 采用real-time PCR检测SKOV-3细胞和IOSE80细胞中miRNA-29b表达水平。收集对数生长期SKOV-3细胞和IOSE80细胞，使用TRIzol试剂提取细胞总RNA，使用反转录试剂进行反转录得到总cDNA，使用荧光定量试剂进行定量，miRNA-29b表达检测使用U6作为内参。miRNA-29b相对表达按照2-ΔΔCt进行计算。

1.4 细胞转染 处于对数生长期的SKOV-3细胞消化收集，按照106/孔的密度接种于六孔板中，经过24 h培养后，使用LipofectamineTM2000转染试剂按照试剂盒操作方案将miRNA-29b mimic和mimic control miRNA分别转染到SKOV-3细胞中。将细胞分为空白组(Blank)、阴性对照组(Negative control)及miRNA-29b转染组(miRNA-29b)。

1.5 细胞增殖能力检测 采用CCK-8试剂检测SKOV-3细胞增殖能力，收集对数生长期的细胞，按照104/孔的密度接种于96孔板，细胞分组同上述3组，实验操作按照CCK-8试剂盒进行，采用全自动酶标仪检测光密度(D490)值，计算各组细胞增殖能力。

1.6 细胞侵袭能力检测 采用Transwell法检测miRNA-29b转染对SKOV-3细胞侵袭能力的影响。使用浓度为1 mg /mL的Matrigel胶体提前将Transwell培养板的上室进行包被，下室加入DMEM培养基，正常培养24 h后取出，放置于显微镜下随机选取视野进行计数。

1.7 细胞蛋白表达水平检测 采用Western 印迹法检测细胞中蛋白的表达水平。细胞分组同上，使用RIPA细胞裂解液裂解细胞得到总蛋白，使用BCA法进行蛋白浓度定量，使用SDS-PAGE进行蛋白电泳，使用PVDF膜进行电转，经4℃封闭过夜，次日使用相应二抗孵育后通过ECL试剂进行化学发光，定量检测目标蛋白表达水平。

2 结 果

2.1 miRNA-29b在不同细胞中的表达差异 结果(图1)显示：人卵巢癌上皮细胞系SKOV-3细胞中miRNA-29b的表达显著下降，与人正常卵巢上皮细胞系IOSE80细胞差异有统计学意义(P<0.01)。

图1 不同细胞中miRNA-29b的相对表达水平

2.2 miRNA-29b mimic转染对SKOV3细胞增殖能力的影响 结果(图2)表明：SKOV3细胞转染miRNA-29b mimic后，细胞中miRNA-29b的表达上调，与阴性对照组差异有统计学意义(P<0.01)。CCK-8法检测结果(图3)显示：转染miRNA-29b组SKOV3细胞从第4天开始增殖能力下降，明显低于阴性对照组细胞(P<0.05)。而空白组及阴性对照组差异无统计学意义，证实miRNA-29b表达能够抑制SKOV3细胞增殖。

图2 各组细胞中miRNA-29b的表达水平

图3 各组细胞增殖能力的对比

2.3 miRNA-29b转染对SKOV3细胞侵袭能力的影响 结果(图4)显示：转染miRNA-29b显著减少了通过聚碳酸酯膜的SKOV3细胞数量，抑制了SKOV3细胞的侵袭能力，与阴性对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)，而空白组及阴性对照组相比差异无统计学意义。

2.4 miRNA-29b转染对凋亡相关蛋白Bcl-2和侵袭相关蛋白MMP-9表达的影响 结果(图5)显示：转染miRNA-29b mimic后，卵巢癌细胞SKOV3中抑制凋亡蛋白Bcl-2和侵袭相关蛋白MMP-9的表达均下调，与阴性对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)；空白组及阴性对照组差异均无统计学意义。

图4 各组细胞侵袭能力的对比

图5 各组细胞中Bcl-2和MMP-9蛋白表达水平的对比

3 讨 论

恶性肿瘤的发生涉及人体多种原癌基因和抑癌基因的表达失衡。与其他恶性肿瘤一样，卵巢癌的发生发展是多因素影响下的多基因、多步骤的恶性增殖的动态过程，其中miRNA所调控的基因表达机制在卵巢癌的发生发展中发挥了重要作用。miRNA-29是在2003年由Dostie等[5]在人神经元中发现，其编码序列位于人体染色体的1q32.2:207801852-207801939位点。miRNA-29家族成员主要包括miRNA-29a、miRNA-29b和miRNA-29c，其中miRNA-29b主要定位于细胞核中，能够与多种目标靶基因的mRNA发生特异性结合，从而在调控目标基因的表达水平[5]。Wang等[6]研究证实，人乳腺癌组织中miRNA-29b的表达异常增加；以人乳腺癌细胞MDA-MB-231为模型，发现抑制miRNA-29b的表达后能够促进抑癌蛋白PTEN的表达，从而抑制乳腺癌细胞的增殖和侵袭能力。而在人前列腺癌细胞PC3和LNCaP中，miRNA-29b的表达下降；通过慢病毒转染增强前列腺癌细胞中miRNA-29b的表达水平，能够显著抑制前列腺癌细胞的侵袭能力，其作用可能与E-cadherin相关信号通路有关[7]。在原发性肝癌中，血清miRNA-29b的表达下降程度与患者的疾病进展和预后显著相关，证实miRNA-29b在原发性肝癌中发挥抑癌作用[8]。本研究中，人卵巢癌上皮细胞系SKOV-3细胞中miRNA-29b的表达下降；与IOSE80细胞相比，转染miRNA-29b mimic后，SKOV-3细胞中miRNA-29b的表达水平增加，SKOV3细胞增殖能力从第4天开始下降，同时SKOV3细胞的侵袭能力下降，初步证实了miRNA-29b在卵巢癌中发挥了抑癌基因的作用。

B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2, Bcl-2)是重要的细胞凋亡蛋白之一。研究认为，Bcl-2能够显著抑制由多种细胞毒因素(如化疗)所引起的凋亡机制，同时能够增强肿瘤细胞对DNA损伤因子的抗性，可作为原发性上皮性卵巢癌的耐药性和预后判断的预测因子[9]。本研究发现，转染miRNA-29b mimic后，卵巢癌细胞SKOV3中抑制凋亡蛋白Bcl-2的表达降低，与阴性对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。基质金属蛋白酶-9(matrix metalloprotein-9, MMP-9)能够降解细胞外基质的锌离子依赖型内肽酶，与多种恶性肿瘤的侵袭性密切相关[10]。已有研究发现，MMP-9在卵巢癌组织中高表达，且其表达水平与卵巢癌患者的生存期负相关[11]。而Zou等[12]的研究显示，MMP-9调控卵巢癌细胞的侵袭能力是与IL-6的介导作用密切相关。转染miRNA-29b mimic后，卵巢癌细胞SKOV3中侵袭相关蛋白MMP-9的表达降低，与阴性对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。

综上所述，本研究发现，miRNA-29b能够抑制卵巢癌细胞的增殖和侵袭能力，具有作为卵巢癌早期诊断和靶向治疗的分子靶点的潜在价值，其作用可能通过抑制凋亡相关蛋白Bcl-2和侵袭相关蛋白MMP-9的表达来实现。