马元吉， 邹云增， 葛均波

复旦大学附属中山医院心内科，上海 200032

作为影响急性心肌梗死(myocardial infarction, MI)发生和发展的两个重要危险因素，高脂血症和高血压病具有较强的协同作用，而氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)和血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)在这其中起着重要的作用。研究[1]发现，树突状细胞(dendritic cells, DCs)在动脉硬化斑块及梗死心肌中发生聚集。而本课题组发现，ox-LDL[2]和AngⅡ[3]能诱导DCs的成熟。因此，本研究通过体外模拟高脂血症小鼠心肌梗死(myocardial infarction, MI)和肾素-血管紧张素系统(RAS)被激活的内环境，进一步研究ox-LDL在AngⅡ的基础上诱导DCs成熟、迁移及对其引起的炎症反应的影响，并探讨可能参与其中的信号通路。

1 材料与方法

1.1 DCs的培养和分组 将C57BL/6J小鼠处死后，置入75%乙醇中浸泡，剪下双侧股骨，进行骨髓腔冲洗，将得到的骨髓细胞悬液以1 500 r/min(r=6 cm)离心 10 min，去上清。用1 mL培养基重悬细胞沉淀，再用200目滤网过滤。取9 mL含有粒细胞巨噬细胞刺激因子(GM-CSF)和IL-4的DCs培养基冲洗滤网，得到细胞悬液10 mL，置于含有5% CO2、37℃恒温培养箱中培养48 h。换液、半量换液。培养到第6天时，细胞计数并接种到六孔板，进行药物干预，持续48 h。分组：Medium alone组、AngⅡ(100 nmol/L)组、ox-LDL(50 μg/mL)+AngⅡ组；3组样品均加入等量的坏死心肌细胞上清液。

1.2 酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞因子IL-6、TNF-α及IL-10的浓度 取DCs上清液。按照R&D system公司提供的试剂盒进行IL-6、TNF-α及IL-10的检测。用酶标仪于450 nm波长处测定光密度(D450)值，计算结果。

1.3 流式细胞术 取100 μL细胞悬液，参照抗体说明书加流式抗体(anti-CD83, anti-CD86)，避光4℃孵育45 min，PBS缓冲液洗涤；以1 500 r/min(r=6 cm)离心10 min；重复操作1次；弃上清，再加入400 μL PBS重悬细胞，上机进行流式细胞检测。

1.4 细胞迁移测定(划痕实验) 细胞培养至单层；PBS洗涤，培养基饥饿16 h；用无菌Tip划出一道划痕，PBS洗涤2次，去除划下和未贴壁细胞，显微镜下拍照；加入ox-LDL和(或)AngⅡ，继续培养24 h，显微镜下成像；计数迁移至划痕区的细胞[2]。

1.5 坏死心肌细胞的制备 为了获得坏死的心肌细胞，体外模拟心肌梗死的内环境，把HL-1心肌细胞在液氮冷冻，再37℃解冻，反复冻融5次。通过胎盘蓝染色观察坏死细胞数量，证实坏死细胞为90%以上。以3 000 r/min(r=6 cm)离心10 min，收集坏死心肌细胞上清液待用[3]。

1.6 蛋白免疫印迹法 收集细胞，抽提蛋白，测定浓度，SDS-PAGE电泳，转膜。封闭后，将膜置于抗体孵育盒，参照抗体说明书加入合适浓度的一抗，室温温育2 h或4℃过夜(>8 h)。洗膜，然后用1∶5 000 HRP标记的二抗孵育膜1 h，曝光显影。

1.7 统计学处理 采用SPSS 21.0软件进行统计学分析，多组间比较用单因素方差分析(one-way ANOVA)，两组间比较采用t检验。检验水准(α)为0.05。

2 结 果

2.1 ox-LDL在AngⅡ基础上进一步增强DCs的迁移 结果(图1A)显示：AngⅡ能够增强DCs迁移，而ox-LDL可以在AngⅡ基础上进一步诱导DCs的迁移(P<0.05)。

2.2 ox-LDL在AngⅡ基础上进一步诱导DCs免疫成熟标志和协同刺激分子的表达 结果(图1B)表明：AngⅡ能够促进DCs表达成熟标志物CD83和协同刺激分子CD86；ox-LDL能够在AngⅡ的基础上进一步诱导CD83、CD86的表达(P<0.05)，说明高脂内环境较单纯的MI内环境能够进一步激发体内的炎症机制，加重梗死后心肌炎症反应。

2.3 ox-LDL在AngⅡ基础上进一步诱导DCs分泌炎性因子 结果(图1C)显示：ox-LDL能够在AngⅡ基础上进一步促进TNF-α和IL-6的分泌(P<0.05)，说明高脂状态刺激下进一步促进DCs的炎性因子的释放，加重炎症反应。

图1 ox-LDL在AngⅡ基础上进一步诱导DCs迁移能力(A)、成熟(B)和炎症因子分泌(C)

2.4 ox-LDL+AngⅡ可以诱导DCs激活NF-κB信号通路 结果(图2)表明：与单纯给予AngⅡ干预相比，ox-LDL+AngⅡ可以进一步诱导IκB和NF-κB磷酸化(P<0.05)。

图2 ox-LDL和 AngⅡ对NF-κB信号通路的影响

*P<0.05 与 Medium alone相比；&P<0.05 与 AngⅡ相比

2.5 ox-LDL+AngⅡ能够诱导DCs激活Toll样受体4(TLR4)信号通路 结果(图3A)表明：ox-LDL在AngⅡ的基础上上调了TLR4和髓样分化因子88(MyD88)的表达，同时上调了TLR4下游分子IRAK-4的磷酸化程度(P<0.05)；ox-LDL对TRIF的表达影响不大。结果提示，ox-LDL在AngⅡ的基础上进一步激活TLR4-MyD88-IRAK-4信号通路。

2.6 ox-LDL+AngⅡ能够诱导DCs表面血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体-1(LOX-1)的表达 结果(图3B)表明：ox-LDL在AngⅡ的基础上能进一步上调LOX-1受体的表达(P<0.05)，提示LOX-1可能介入了高脂环境下DCs的进一步免疫成熟和炎症反应。

图3 ox-LDL+AngⅡ对DCs激活TLR4信号通路及LOX-1表达的影响

A：ox-LDL和AngⅡ对TLR4-Myd88信号通路的影响；B：ox-LDL+AngⅡ诱导LOX-1进一步表达.*P<0.05 与 Medium alone相比；&P<0.05 与 AngⅡ相比

3 讨 论

ox-LDL具有细胞毒性，是早期心室重构的危险因子，影响心脏结构和功能[4-5]。既往研究证明，ox-LDL在心脏组织中的浓度可能远高于其血液浓度，可以在损伤内皮后直接作用于心肌细胞，从而导致心肌细胞肥厚[6]。还有研究[7]提示，MI后患者血清ox-LDL抗体水平显著升高，并与MI患者死亡率正相关。同样，MI后外周血液中AngⅡ水平激增[8-9]，同时影响梗死区和非梗死区的心肌重构。

AngⅡ与ox-LDL之间有密不可分的联系[10-11]。AngⅡ和ox-LDL分别可增加冠脉内皮细胞血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体-1(LOX-1)和血管紧张素转换酶(ACE)的表达。DCs在动脉硬化斑块及梗死心肌中发生聚集，而ox-LDL[2]和AngⅡ[3]能诱导DCs的成熟。LOX-1是摄取和代谢ox-LDL的主要受体[12]。LOX-1主要表达于血管内皮细胞及纤维母细胞[13]等，而近年研究发现其在DCs表面也有表达[14]，参与抗原递呈过程。

为了揭示高脂环境下DCs免疫成熟以及炎症反应，本研究通过体外培养C57BL/6J小鼠的骨髓细胞，采用GM-CSF及IL-4诱导分化DCs。同时，为了模拟小鼠高脂及MI后RAS激活的内环境，本研究利用AngⅡ和ox-LDL干预DCs观察其免疫成熟和炎症反应情况，结果发现ox-LDL在AngⅡA基础上进一步诱导DCs免疫成熟和致炎性因子的分泌。

既往研究证实TLR4、NF-κB和LOX-1共同表达于DCs[14-15]。TLRs在免疫应答中可以通过MyD88信号通路和TRIF信号通路进行信号转导。研究[16]显示，ox-LDL诱导循环及系统炎症部分可能通过TLR4途径实现，这提示TLR4可能在脂质分子和炎症反应及MI间扮演着重要角色。既往研究[17]证实，TLR4参与动脉粥样硬化的炎症反应。另外，TLR4表达上调还被认为与急性冠脉综合征[18]以及C反应蛋白正常的冠心病患者的严重程度正相关[19]。NF-κB作为一个多向性核转录因子，参与调节免疫炎症反应和细胞增殖等。研究发现，NF-κB与动脉粥样硬化[20]和冠心病[21]的炎症反应有着密切联系。NF-κB不仅能够介导TLR4下游信号传导，而且，还能反向上调TLR4的表达，两者之间可能存在正反馈过程[22]。

本研究发现，在AngⅡ和ox-LDL同时干预时，NF-κB/IκB的磷酸化增强，提示NF-κB通路参与了ox-LDL进一步诱导DCs免疫成熟和炎症反应过程。本研究还发现，ox-LDL+AngⅡ可以诱导DCs中TLR4/MyD88的激活和IRAK-4的磷酸化；而TRIF在ox-LDL+AngⅡ作用下，表达未明显增强。IRAK-4的磷酸化是激活NF-κB通路的重要步骤，因此推断TLR4/MyD88-NF-κB通路参与DCs免疫成熟和炎症反应过程[23]。

综上所述，本研究发现，ox-LDL在Ang Ⅱ基础上进一步上调了LOX-1的表达，同时激活了TLR4/MyD88-NF-κB通路，说明LOX-1和TLR4/MyD88-NF-κB通路均介入了DCs参与高脂血症合并心肌梗死发生和发展的过程。