洪静 冯珍

摘 要 目的：本实验通过检测胃癌患者和正常人尿液中游离氨基酸代谢谱，筛选出具有诊断意义的氨基酸，并探讨胃癌患者尿液氨基酸代谢变化的规律和意义。方法：留取晨尿162例分3组，采用离子色谱法检测3组尿液中22种氨基酸，应用色谱软件，构建尿液氨基酸代谢谱，对所得数据进行统计学处理。结果：胃癌组尿液氨基酸代谢谱较正常组有明显变化；不同分期胃癌组的氨基酸代谢谱也存在差异。结论：异亮氨酸等6种氨基酸可能是参与肿瘤生长和转移过程中细胞增殖和基因表达的重要代谢产物；异亮氨酸和缬氨酸在早期胃癌中可能是重要的代谢产物。

关键词 胃癌 早期诊断 代谢组学 离子色谱 游离氨基酸

中图分类号：R735.2 文献标志码：A 文章编号：1006-1533（2018）11-0051-04

Analysis of free amino acid metabolic profiling in urine of gastric cancer patients by ion chromatography

HONG Jing*， FENG Zhen

（Department of Gastroenterology， the Central Hospital of Xuhui District， Shanghai 200031， China）

ABSTRACT Objective： To screen out amino acids with diagnostic significance by detection of metabolic profiling of free amino acids in urine samples of both patients with gastric cancer at different stages and healthy people and to explore the regularity and significance of the changes of amino acid metabolic profiling. Methods： One hundred and sixty-two urine samples were collected and divided into 3 groups. Twenty-two amino acids in each urine sample were detected by ion chromatography（IC） and then the metabolic profiling of amino acids in the urine sample was established with Peaknet 6 software and the obtained data were statistically analyzed. Results： There existed significant differences between patients with gastric cancer and healthy people and even the patients at different stages in metabolic profiling of free amino acids in urine. Conclusion： Six amino acids including isoleucine， valine， leucine， methionine， histidine and aspartic acid may be important metabolites involved in cell proliferation and gene expression during tumor growth and metastasis and isoleucine and valine may also be important metabolites in early gastric cancer.

KEy WORDS gastric cancer； early diagnosis； metabolomics； ion chromatography； free amino acids

胃癌是人類最常见的恶性肿瘤之一，是全球第二大癌症致死性疾病[1]。早期胃癌缺乏特异性症状，诊断十分困难[2]。临床上发现的胃癌多数已处于进展期，病死率高，严重危害人民健康[3]。然而胃癌病因尚未完全明确，在缺乏有效的一级预防情况下，二级预防中的早期诊断就显得尤为重要。目前内镜结合活组织病理检查的诊断方法虽然较为成熟，但诊断准确率尚有赖于内镜医师的经验，且在人口众多的我国，普查难以符合国情，因此寻求更加方便和简单的胃癌早期诊断方法意义重大。近年来，代谢组学的飞速发展给胃癌的诊断提出了新的思路[4-5]。代谢组学旨在运用各种先进的检测技术对肿瘤患者体内的小分子代谢产物进行定性和定量分析，试图找出更有诊断价值的生物标志物[6-9]。本实验通过检测不同分期胃癌患者尿液中游离氨基酸代谢轮廓，将其与正常人相比较，筛选出可能具有诊断意义的氨基酸。

1 材料和方法

1.1 仪器

Dionex ICS-3000离子色谱仪、Peaknet 6 色谱工作站（ Thermo Fisher Scientific 公司）；1-15k 3K-15低温冷冻离心机、TYPE B2生物安全柜（美国Sigma公司）；BDC-280e冷藏冰箱（伊来克斯公司）；XW-80A旋涡振荡器（上海青浦泸西仪器厂）；K10CD干式恒温器 （杭州蓝焰科技有限公司）；ZXC紫外消毒车（上海跃进医用光学器械厂）；JA1203N电子天平（上海精密科学仪器有限公司）。

1.2 试剂

20种氨基酸对照液、鸟氨酸（99.5%）和胱氨酸（99%）对照品（分析纯，美国Sigma公司）；高纯水（电阻≥18.0 MΩ，天津纳科水处理有限公司）； 0.22 mm滤膜（上海市新亚净化器件厂）。

1.3 标本采集和入选标准

共162例晨尿样品，其中男性95例，女性67例，年龄25～87岁，中位年龄59岁，平均年龄（62±17.5）岁。82例胃癌患者的尿液取自复旦大学中山医院徐汇医院消化内科于2016年2月至2017年5月收治的住院病人，80例正常對照尿液取自健康成年人。胃癌分期参照国际抗癌联盟（Union for International Cancer Control，UICC）倡导的TNM分期法：Ⅰ期和Ⅱ期为早期胃癌组，Ⅲ期和Ⅳ期为进展期胃癌组。胃癌患者分期均通过胃镜和黏膜活检病理诊断证实。所有入选者同时排除手术、化疗、肾脏疾病及内分泌代谢类疾病。每例留取晨尿5 ml，分装EP管后置于-40 ℃保存。

1.4 标本分组

A组为Ⅰ～Ⅱ期胃癌（n=27）；B组为Ⅲ～Ⅳ期胃癌（n=55）；C组为健康成年人（n=80）。

1.5 样本处理与保存

将尿液样品从-40 ℃冰箱取出后在4 ℃下解冻，离心5 min（4 000 r/min，4 ℃），取上清液直接注入装有滤膜的分离管中。待测样本需冷藏保存，超过2 d的样本需-40 ℃保存。

1.6 样本检测

色谱分析采用AminoPac PA10 分离柱（2 mm×250 mm）与AminoPac PA10保护柱（2 mm×50 mm），流速0.25 ml/min，柱温度30 ℃，进样体积25 ml。分析样品前用H2O-0.25 mol/L NaOH=4∶1（V/V）的淋洗液作流动相，以0.25 ml/min的流速平衡色谱体系30 min。

依照22种标准氨基酸图谱的各氨基酸出峰时间和峰型，对制备尿样色谱图中色谱峰进行氨基酸（AA）定性分析；并结合仪器自带的Peaknet 6 色谱工作站软件，计算出每个物质的相对峰面积（relative peak area），作为定量结果进行数据统计处理。

1.7 统计学分析

对色谱峰峰面积进行归一化处理后进行主成分分析（principal component analysis，PCA），构建不同分期胃癌组及正常对照组尿液中AA代谢谱，直观地观察代谢产物信息。所有数据均以统计软件SPSS 16.0进行处理分析，结果以均数±标准差表示，各组比较采用单因素方差分析；方差不齐时采用秩和检验，P<0.05为差异有统计学意义。在AA的定量分析中，本实验采用的是每个AA峰面积与TAA的峰面积之比，即用相对峰面积作为原始变量进行数据的统计分析，原因是相对峰面积比实际浓度能更好的反映出每个尿样FAA之间的相互比例关系。对3组的22种AA色谱峰依照标准分析图谱进行定性分析后，运用Peaknet 6色谱工作站软件计算每个AA相对于总氨基酸（TAA）的相对峰面积，结果以均数±标准差表示，并进行t检验。

2 结果

2.1 实际尿液样本氨基酸代谢谱分析

离子流（IC）分析正常组与胃癌组尿样色谱峰总离子流（total ion current，TIC）情况，结果显示非胃癌组与胃癌组尿样色谱峰总离子流有差异，在同一保留时间，可见色谱峰的大小、高低不同（图1）。

2.2 组间比较

与正常组相比，早期胃癌组和进展期胃癌组的缬氨酸（Val），异亮氨酸（Ile）和亮氨酸（Leu）水平升高（P<0.05）， 组氨酸（His）水平降低（P<0.05）， 甲硫氨酸（Met），天冬氨酸（Asp）水平明显下降（P<0.01，表1）；不同分期胃癌组的氨基酸代谢谱也存在差异，进展期胃癌组异亮氨酸和缬氨酸水平较早期胃癌组下降（P<0.05，表2）。

3 讨论

通过对胃癌组和正常组的尿液样本的离子色谱图TIC做组内比较观察，发现存在个体差异性，主要表现在波峰的高度和宽度不尽相同，提示我们尿液的相同代谢成分的浓度不同。作组间比较，可以发现组间差异大于组内差异。特别是胃癌组与正常组之间差异较大。由于IC技术的局限性，在离子定性分析时必须参照标准图谱，加上尿液的成分复杂，各种信号容易产生重叠和交叉，无疑为谱图的准确分析带来了巨大的困难，因而本次实验重点在于对标准图谱上已知的22种氨基酸进行各组的归纳分析。

在AA的定量分析中，本实验采用的是每个AA峰面积与总氨基酸（TAA）的峰面积之比，即用相对峰面积作为原始变量进行数据的统计分析，原因是相对峰面积比实际浓度能更好地反映出每个尿样中游离氨基酸（FAA）之间的相互比例关系。胃癌患者尿液中氨基酸代谢谱较正常人有明显变化，说明异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、组氨酸和天冬氨酸等可能是参与肿瘤生长和转移过程中细胞增殖和基因表达的重要代谢产物；异亮氨酸和缬氨酸水平在早期胃癌组较晚期组上升，提示二者在早期胃癌中可能是重要的代谢产物。尽管我们对以尿液游离氨基酸的代谢谱为基础的胃癌诊断模型的建立进行了初步的研究，但该模型还有待更多的大规模样本检测来进一步验证和探讨。

参考文献

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