王冲 付秋雁 谭建新 于玲莉 刘芬 董正龙 李建平

摘 要 本着“服务创新驱动、保障药品质量安全”的宗旨，为支持和推动嵌合抗原受体T细胞（chimeric antigen receptor T cell， CAR-T）类免疫细胞产品的产业化进程，探讨风险控制策略，并按药品管理规范指导和规范这类产品的产业化，由上海药品审评核查中心组织发起，上海市免疫细胞治疗产业联盟的相关企业共同参与，起草编撰了《自体CAR-T免疫细胞产品生产指南（讨论稿）》。该生产指南经过业界专家的多次讨论和多方征求意见，现已形成初稿，本文就其编撰及内容作一简要介绍并提出相关思考，希望能给业界提供参考和借鉴。

关键词 嵌合抗原受体T细胞 免疫细胞治疗 生产指南

中图分类号：R951 文献标志码：C 文章编号：1006-1533（2018）11-0015-06

Consideration on drafting a discussion paper on Guidelines for the Production of Autologous CAR-T Immune Cell Products

WANG Chong*， FU Qiuyan， TAN Jianxin， YU Lingli， LIU Fen， DONG Zhenglong， LI Jianping**（Shanghai Center for Drug Evaluation and Inspection， Shanghai 201203， China）

ABSTRACT To discuss the risk control strategy and guide and regulate the industrialization of chimeric antigen receptor T cell （CAR-T） immune cell production according to the specifications of drug management so as to implement the strategy for the innovation-driven development and ensure drug quality and safety and promote and support the industrialization and standardization of such pharmaceuticals. The discussion paper on the Guidelines for the Production of Autologous CAR-T Immune Cell Products was drafted and compiled by Shanghai Center for Drug Evaluation and Inspection combined with the Shanghai Alliance for Immune Cell Therapy Industries. A first draft of these production guidelines was formed after many discussions and multi-party comments by industry experts. A brief introduction to its compilation and content was given and the relevant thinking was proposed in this article.

KEy WORDS chimeric antigen receptor T cell； immune cell therapy； production guidelines

諾华公司开发的CTL-019获得美国FDA肿瘤药物咨询委员会全票批准推荐的消息引起了医药界对嵌合抗原受体T细胞（chimeric antigen receptor T cell， CAR-T）疗法的高度关注。这是因为，CAR-T是一类区别于传统小分子和生物药物的新药物形态，可为肿瘤治疗提供一种新型治疗手段，且其作用已基本得到全球权威药品审评机构美国FDA的认可[1]。我国之前按照国家卫生部的相关规定和要求，参照卫生部发布的《医疗技术临床应用管理办法》[2]，将自体干细胞和免疫细胞疗法列为第三类医疗技术予以管理。鉴于免疫细胞治疗技术渐趋完善，2017年12月国家食品药品监督管理总局药品审评中心印发了《细胞治疗产品研究与评价技术指导原则》（试行）[3]。该指导原则适用于符合《中华人民共和国药品管理法》第一百零二条关于药品的定义并符合以下要求的产品：①来源于人自体或异体的活细胞，但不包括生殖细胞及其相关干细胞；②可与辅助材料结合或经体外诱导分化、或进行基因改造操作的人源细胞。这意味着细胞治疗产品研发可以参照《药品注册管理办法》进行规范管理了。

随着相关技术的不断发展，全球、包括我国的免疫细胞治疗产业正在迅速形成并壮大。上海市作为全国的科创中心及生物医药研发产业重地，在CAR-T类免疫细胞产品研发方面颇为活跃且已初具产业化基础，跨过早期研发阶段进入立项到申报前阶段的企业为数不少，有些企业已有或正在建生产车间，发展水平处于国内领先地位。但国内尚无成功申报获得批准上市的CAR-T类免疫细胞产品案例，现有的相关法规和常规的药品管理方式又不完全适用于这类产品，研发企业正面临申报和厂房建设要求方面的困境，监管部门也面临如何提高专业监管能力等多方面的挑战[4]。

为支持和推动上海市CAR-T类免疫细胞产品的产业化进程，探讨风险控制策略，并按药品管理规范指导和规范这类产品的产业化，由上海药品审评核查中心组织发起，上海市免疫细胞治疗产业联盟相关企业共同参与，起草编撰了《自体CAR-T免疫细胞产品生产指南（讨论稿）》（以下简称为“生产指南”）。该生产指南经过业界专家的多次讨论和多方征求意见，现已形成初稿，本文就其编撰依据及主要内容作一简要的框架性介绍并提出相关思考。

1 编撰依据

《药品生产质量管理规范（2010年修订）》[5]、《药品生产质量管理规范（2010年修订）》附录1“无菌药品”[6]和欧盟发布的《Guidelines on Good Manufacturing Practice specific to Advanced Therapy Medicinal Products》[7]。

2 主要内容

CAR-T是一类新型免疫细胞产品，其由符合伦理学要求的细胞经体外培养和嵌入针对特定抗体的抗原制成。本生产指南旨在为CAR-T类免疫细胞产品的规范生产和质量控制提供参考和借鉴，并探讨了风险控制策略。

2.1 厂址选择和厂房整体布局

为降低污染和交叉污染风险，厂房、生产设施及设备应根据所生产药品的特性、工艺流程和相应的洁净度级别要求合理设计、布局和使用。

2.1.1 生产区和贮存区

生产区和贮存区应有足够的空间，以确保能有序地存放设备、物料、中间产品、待包装产品和成品，避免不同产品或物料的混淆、交叉污染，避免生产或质量控制操作发生遗漏或差错。

应根据药品品种、生产操作要求和外部环境状况等配置空调净化系统，使生产区有效通风，并有温度、湿度控制和空气净化过滤，保证药品的生产环境符合要求。洁净区与非洁净区之间、不同级别洁净区之间的压差应≥10 Pa；必要时，相同洁净度级别的不同功能区域（操作间）之间也应保持适当的压差梯度。

2.1.2 生产中间控制区

生产中间控制区如设置在洁净生产车间内部，应避免交叉污染、混淆等药品质量风险。

2.1.3 仓储区

仓储区的设置和分区应避免不同产品或物料的混淆和交叉污染。①体细胞接收区：应每份体细胞均贴有完整标签，进行唯一识别码登记、编录和标识。应有独立的血液样本存放冰箱，并根据生产工艺合理制定血液样本的接收、储存和发放规程。②原辅料储存区：同药品GMP。③CAR-T产品储存区：应注意液氮罐补充液氮的便捷性，并对液氮储存条件进行适当的监测。使用不同液氮罐或同一液氮罐、但不同栏架储存待检品、成品、留样和稳定性考察的CAR-T产品时，应进行必要的风险评估，并采取相应的控制措施。

2.1.4 质量控制区

一般需分为体细胞检测区、细胞检测区、微生物检测区、理化检测区和分子检测区等。体细胞检测区应独立设置，使用专用检验设备，并应配备原位灭活或消毒的设备。如有空调净化系统，应独立设置。应有独立的分子检测区域，以避免气溶胶的产生与交叉污染。分子检测区域应至少包括试剂准备、标本制备和基因扩增三个功能操作间，三个功能操作间应相互独立，避免空气的直接流通，以避免交叉污染。如具备条件，建议每个区域配置缓冲间。基于风险，部分区域应设置独立的废气排放系统。

2.1.5 辅助区

包括清洗清洁区、灭菌区和废弃物处理区。应有独立的废弃物处理区，对生物活性物质进行灭活处理。

2.2 生产设备

主要生产设备如生物安全柜、离心机、冰箱、显微镜、纯化设备、过滤设备和泵等的设计或选型、校验、清洗和维护的要求同药品GMP。宜使用一次性系统，以避免污染和交叉污染。

CAR-T产品生产中需用到一些特殊设备。①分选设备：分选设备一般为含有磁力的设备系统，操作和放置时应注意周围不得有磁性物体，以避免干扰及长期干扰后产生磁性。②中间体检测用到的设备：常用的中间体检测设备如流式细胞仪、细胞计数仪和显微镜的设计或选型、校验、清洗和维护的要求同药品GMP。

质粒、病毒载体和CAR-T产品的生产区应分别设置为独立区域，病毒载体和CAR-T产品的生产不应共用空调净化系统。

2.2.1 质粒生产设备

在CAR-T产品的生产过程中，如有质粒中间品，应有独立的质粒生产区。质粒生产区内应至少包括发酵、纯化和除菌分装三个功能区，其中发酵和纯化功能区至少为控制区，除菌分装功能区的洁净度至少为“C+A”。宜选用耐高温高压灭菌的系统或一次性发酵系统，以避免不同种质粒或不同批次质粒的交叉污染。如未使用耐高温高压灭菌的系统或一次性发酵系统，则至少每种质粒发酵使用一种系统。不同种质粒的纯化不得共用同一纯化层析柱和层析介质。由于质粒的生产宿主是革兰阴性菌大肠埃希菌，纯化系统应确保能有效去除宿主菌残留的内毒素。

2.2.2 病毒载体生产设备

病毒载体的生产区应符合药品GMP要求。病毒载体生产区应至少分为细胞培养、病毒转染（如有）、病毒纯化和除菌过滤等功能区。应选用耐高温高压灭菌的系统或一次性发酵系统，以避免不同批次的交叉污染及外源性微生物污染。

2.2.3 CAR-T产品生产设备

CAR-T产品的生产区应符合药品GMP要求。CAR-T产品生产区应至少分为体细胞分离分选、细胞扩增和细胞冷冻（如有）等功能区。CAR-T产品的生产应符合无菌技术操作规范。為避免不同来源T细胞的交叉污染，CAR-T产品生产过程中宜选用一次性生产用耗材。

如CAR-T产品的生产采用非全封闭系统操作，应避免不同供者来源体细胞的CAR-T产品生产发生交叉污染、污染和混淆，操作完毕后须清场；如CAR-T产品的生产采用了全封闭系统操作，应注意避免在取样、加样等环节可能发生的交叉污染。对部分非全封闭系统操作，应按非全封闭系统要求执行。

2.2.4 公用系统

压缩空气、二氧化碳和氧气（同药品GMP要求）。水系统（同药品GMP要求）。

2.3 生产过程

CAR-T产品生产主要分为三个生产过程。①质粒生产过程（如有）：至少包括细菌复苏、细菌扩增、细菌破碎、质粒纯化和除菌过滤等工艺流程。②病毒载体生产过程：至少包括细胞扩增、质粒转染（如有）、病毒收获、病毒纯化和除菌过滤等工艺流程。③CAR-T产品生产过程：至少包括细胞分离、细胞分选（如有）、T细胞激活、病毒感染、细胞扩增、细胞收获和细胞冷冻（如有）等工艺流程。

2.3.1 质粒生产过程（如有）

质粒生产以复苏携带质粒的工程菌为起始点，经细菌扩增，收获细菌，裂解、破碎菌体后释放质粒，去除相关细菌蛋白和细菌基因组，去除细菌内毒素，纯化得超螺旋质粒，最后除菌过滤获得质粒中间品。

2.3.2 病毒载体生产过程

病毒载体的生产过程如下：扩增生产细胞至一定规模（如采用瞬转工艺，则需投入质粒和转染复合物以包装出目的病毒），收获病毒上清液，经纯化和去除牛血清白蛋白、DNA和蛋白等杂质后，浓缩至一定滴度，最后除菌过滤获得病毒载体中间品。

2.3.3 CAR-T产品生产过程

CAR-T产品的生产需先获取供者或患者的免疫细胞，经分离、分选（如有）获得T细胞，激活后再使用病毒载体感染T细胞，扩增生产至一定量，收获CAR-T并清洗。

2.3.4 非冷冻制剂生产过程

在清洗后的CAR-T中加入生理盐水或其他药用辅料，分装至输血袋。

2.3.5 冷冻制剂生产过程

加入冷冻保护剂，分装至冻存袋，从室温冷冻至液氮温度后保存。

2.4 物料

2.4.1 质量标准和标识

参照《中华人民共和国药典》2015年版三部生物制品通则中“生物制品生产用原材料及辅料质量控制规程”对生物制品生产过程中使用的原材料和辅料质量控制的通用性要求。

2.4.1.1 血液样本唯一识别码

供者或患者体细胞的获得应符合伦理学要求，体细胞从入库至生产、检定应编制唯一识别码，并使用该识别码作为对应来源的唯一凭证，同时必须保护隐私信息。

2.4.1.2 物料供应商管理

物料供应商应提供物料质量证明文件或合格证，部分进口试剂和耗材应有进口许可文件。

2.4.2 物料和产品的接收

同《药品生产质量管理规范（2010年修订）》附录3中“生物制品”的要求。

2.4.3 生产过程中的物料管理

同药品GMP，注意质粒（如有）和病毒载体的留样。

2.4.4 检验与放行

2.4.4.1 CAR-T制剂的快速检验与放行

应制定有条件放行的质量标准，以备临床急需。应将重点放在安全性检测项目方面，如无菌检查、支原体检查和病毒自我复制能力检查等。

2.4.4.2 CAR-T制剂的标准检验与放行

应制定适用的检验方法与放行质量标准。

2.4.5 包装和运输储存

CAR-T制剂的外包装上应明确患者的相关信息，外包装材料宜选用保温隔热材料。

如CAR-T制剂保存在液氮中，应注意避免不同批次和不同供者来源的制剂混淆及相互污染，同时对液氮储存条件进行适当的监测。CAR-T制剂运输时应保存在液氮或干冰中，应测试运输条件的稳定性，运输过程中也应对温度进行持续的监测。

在CAR-T制剂出库发货时应核对其唯一识别码，并建立医疗机构接收回执，内容至少包括制剂袋外观检查、输液口完整性检查、接收时间及数量等。

2.5 确认和验证

2.5.1 无抗生素培养无菌工艺模拟验证

在CAR-T产品的生产过程中应进行无抗生素培养无菌模拟工艺验证，以证明生产体系的无菌性、无支原体性。验证时宜选用生产用培养基、缓冲液或增菌培养基等模拟最优和最差培养环境，以验证CAR-T产品的无菌性。

2.5.2 总体工艺验证

通常情况下，工艺验证应至少包括常规生产条件下的三个连续批。如使用其他批数量，应考虑可否通过使用标准生产方法、已有相似产品或工艺、起始物料的可变性、临床适应证等予以合理解释。

对多种质粒生产系统，如生产工艺相同，基于风险评估，可只对其中一种质粒中间品进行工艺验证，结果需符合质粒中间品的质量标准。

CAR-T产品的生产可使用不同来源的T细胞，但结果均需符合CAR-T产品的质量标准。

2.5.3 清洁验证

2.5.3.1 质粒纯化系统（如有）

质粒的纯化系统如为非一次性系统，应进行清洁验证。

2.5.3.2 病毒载体纯化系统

病毒载体的纯化系统如为非一次性系统，应进行清洁验证。

2.5.3.3 CAR-T产品纯化系统

CAR-T产品的纯化系统如为非一次性或非全封闭系统，清洁验证应验证细菌、真菌、分枝杆菌和支原体等项目，以避免交叉污染。如同一个CAR-T产品纯化车间涉及不同种的病毒载体，应进行批间清洁，并对清洁效果进行病毒载体去除验证。

2.6 关键控制项目

病毒载体滴度：病毒载体滴度的检测方法应经验证，确定感染复数范围，确保感染效率符合质量标准。

T细胞占比和T細胞数：对来源于供者的外周血细胞，经分离、分选（如有）获得T细胞群后，应检测其中的T细胞占比和T细胞数。

CAR-T的CAR+占比：病毒感染72 h后，一般宜检测CAR-T的CAR+占比，因为CAR-T在扩增过程中其CAR+占比可能会下降，导致CAR-T产品的CAR+占比不符合质量标准。

3 挑战与思考

3.1 认知的时代性

本生产指南是主要基于目前的认知提出的有关CAR-T类免疫细胞产品良好生产规范方面的一般考虑。随着相关技术发展、认知提高和经验积累，对这类产品生产规范方面的认识必会更加深入、细化和提高。

3.2 个体化治疗产品的特殊性

CAR-T类免疫细胞产品属个体化治疗产品，来源于不同供者的T细胞给生产工艺的标准化和产品的一致性带来了极大的挑战，决定了这类产品在生产的不同工序阶段可能存在着不同的工艺控制路径。因此，相对于传统药品的管理，如何保证这类产品的安全、有效和质量可控具有极大的挑战性。

3.3 为临床试验用样品生产规范提供参考

基于CAR-T类免疫细胞产品的特殊性，这类产品的研究与开发周期与传统药物相比相对较短，因此多数研发机构在早期的生产工艺开发阶段就考虑到了后续临床试验用样品以及商业化生产的需求。本生产指南同样可为临床试验用CAR-T类免疫细胞产品的生产规范提供参考。

3.4 其他类别细胞治疗产品的适用性

本生产指南为CAR-T类免疫细胞产品的规范生产提供参考和建议，以支持和推动这类产品的产业化进程。对其他类别的细胞治疗产品，本生产指南仅供借鉴，但有些通用原则应是基本相同的。

3.5 CAR-T产品的临床需求日益增加

CAR-T类免疫细胞疗法的发展十分迅速，为肿瘤治疗提供了一种新的有效手段。然而，在学术研究阶段，CAR-T产品的生产往往采用科研级别的耗材且未使用全自動生产系统，成本高、生产效率低，无法进行大规模生产。由于临床上对CAR-T产品的需求日益增加，因此可考虑在研发阶段即采用临床许可耗材并设计全封闭的生产系统等，进而加快研发进程。

4 结语

为贯彻落实国家对药品审评审批制度改革的要求，支持和推进上海市前沿生物制药的产业化进程，更好地保障药品质量和安全，上海药品审评核查中心积极创新，专门组建了生物组，主动探索以品种为主线的全链条监管模式。本生产指南是上海药品审评核查中心生物组探索药品全链条监管模式的重要举措之一，希望能实现以监管创新推动药品创新的目标。

致谢：感谢上海食品药品检验所生化药品生物制品室陈钢主任、国家上海新药安全评价研究中心常艳主任、华道（上海）生物医药有限公司、上海恒润达生生物科技有限公司、科济生物医药（上海）有限公司、复星凯特生物科技有限公司、上海药明巨诺生物科技有限公司和通用电气医疗集团生命科学部对本生产指南编撰所给予的专业建议和大力支持；感谢上海药品审评核查中心生物组成员吴浩、张一琼、曹萌、丁力承和刘凌毅对本生产指南编撰的辛勤付出。

参考文献

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