王忠 朱囡囡 陈文浩 谢雯

1安徽医科大学精神医学中心，安徽省精神卫生中心（合肥 230032）；2安徽医科大学精神卫生临床学院，安徽省精神卫生中心（合肥 230022）；3北京大学第六医院，北京大学精神卫生研究所，卫生部精神卫生学重点实验室（北京 100191）

睡眠是一种自发、可逆的周期性状态，人一生约1/3的时间都是在睡眠中度过，当人体处在睡眠状态时，全身放松，身体的各个器官都能得到很好的休息，是机体复原、信息整合和记忆巩固的重要环节［1-2］。然而，随着社会进步、生活节奏的加快、夜生活丰富以及电子网络等产品的使用，睡眠剥夺（sleep deprivation，SD）在现代社会尤其是年轻人中已成为普遍存在的现象［3］。一项横断面的调查报告［4］指出，70%以上的年轻人每天的睡眠时间都少于推荐的睡眠时间，且至少有60%被定义为睡眠严重缺乏。研究［5］表明，良好的睡眠对人体健康特别认知功能的维持极其关键，警觉注意力作为认知的一个最基本维度是完成其他高级认知过程的必要条件，也是SD的高敏感指标，其功能的维持受到昼夜节律及持续觉醒时间影响［6］。食欲素-A（Orexin⁃A）是一种下丘脑特定神经元分泌释放的神经肽，在饮食摄入和能量代谢稳态调节方面起重要作用，且参与睡眠与觉醒状态的调控具有促进和维持醒觉的作用［7］。有研究发现，经鼻给予Orexin⁃A还在改善由SD引起的认知受损方面起重要作用［8］。目前，急性SD普遍存在于制造、医疗服务及运输等行业，SD导致的大脑警觉性与判断力减弱以及思考能力下降会导致许多严重的安全事故的发生，这也使得长期SD日益成为严重的公共卫生问题［9］。本研究通过观察SD及睡眠恢复（sleep recovery，SR）对人体警觉性节律及血清Orexin⁃A水平的影响，探究之间潜在的功能联系，并探讨其中可能的机制，为临床提供可能的生物标志物和治疗靶标。

1 对象与方法

1.1 研究对象 （1）纳入标准：汉族，年龄在18～25岁之间，男女不限，健康大学生；作息时间规律（上床时间在11：00 pm±30 min；起床时间7：00 am±30 min），每天睡眠时间在7～8 h范围内；匹兹堡睡眠质量指数总分≤5分，Epworth嗜睡量表≤10分，汉密尔顿抑郁量表（24项）≤7分，汉密尔顿焦虑量表＜7分，蒙特利尔认知评估≥26分；体质指数（body mass index，BMI）正常（18.5≤ BMI＜25）；腰臀比正常（男性 ＜ 0.9；女性 ＜ 0.88）；无烟酒嗜好或其他物质滥用，无饮用茶、咖啡等功能饮料的习惯。

本临床实验获得北京大学第六医院伦理委员会批准，实验开始前向受试者详细说明实验流程及注意事项，所有受试者均自愿参加本实验并签署知情同意书。

（2）通过上述标准成功纳入28名健康大学生，因中途退出及样本缺失等原因，最终纳入分析的有21名（19～24岁）被试，其中男11人，都经过严格的问卷评估及临床筛查，排除一切可能存在的精神心理、睡眠疾病以及作息不规律、熬夜等不良生活习惯，此外存在癫痫、糖尿病等SD禁忌疾病的被试也被排除在外。

1.2 方法

1.2.1 实验过程 正式实验之前，被试者被要求进行1周的体动记录仪（wGT3x⁃BT，Actigraph，美国佛罗里达州）监测及睡眠日记记录，用以评估其日常活动及作息习惯。且被试会被提前到实验室适应1 d（d1），随后将被要求在严格控制的实验室条件下保持连续40 h的清醒状态（7：00 am～11：00 pm：自由活动但限制剧烈运动；11：00 pm～7：00 am：半仰卧式），期间可以进行阅读、看视频等活动，在40 h SD期间受试者需要一直配戴体动记录仪记录活动状况，如果因受试者未能保持40 h清醒，将不能继续进行剩下的研究，紧接着是8 h的SR。在SD过程中，被试被要求平均每2个小时进行1次精神运动警觉性测试（psychomotor vigilance task，PVT）。在SD开始，SD 24 h及SR后的3个清晨8点进行3次静脉采血及匹配的PVT测试，分别对应的是SD开始，SD 24 h及SR 8 h后3个时间点。

1.2.2 实验方法 （1）本研究使用的是基于Eprime 1.0软件编制的PVT任务，在SD期间，被试会被安排在一个安静、舒适的环境中进行测试，指导语保持一致，任务开始屏幕上会有一个红色方框，提示被试注意屏幕中央，接着会在随机时间间隔下（1 000～9 000 ms）出现一个黄色的计时器，数字由0开始以毫秒（ms）为单位递增，要求被试者尽可能快地按鼠标左键反应，时限为30 s，超时会自动进入下一试次，按键后计时器会停下来，方框变成黄色，被试者可以看到自己的反应时间（reac⁃tion time，RT），时间呈现2 s后消失，方框再次变成红色，下一试次开始，整个任务共计90试次，整个任务大概持续10 min，测试结束后会得到每个被试每一试次的RT，当RT≥500 ms时被定义为走神，当RT≤150 ms被定义为一次错误反应。（2）使用酶联免疫吸附测定法（enzyme linked immuno⁃sorbent assay，ELISA）测定血清中Orexin⁃A的浓度，Orexin⁃A ELISA试剂盒购于武汉伊莱瑞特生物科技有限公司，检测灵敏度约是37.50 pg/mL。

1.3 统计学方法 所有数据分析均使用基于Windows的IBM SPSS 20.0软件进行，连续变量均以±s形式表示。使用Kolmogorov⁃Smirnov和Levene检验分别进行正态性和方差齐性检验。采用重复测量方差分析（ANOVA）分析PVT参数及血清Orexin⁃A水平，采用Pearson相关分析SD前后PVT参数及血清学参数变化（Δ）之间的相关性（Δ被定义为在SD 24 h后的参数减去相对应的基线参数），P＜0.05被认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 人口学及临床一般资料 所有被试的年龄、BMI等人口学信息以及一般临床资料见表1，被试年龄在19～24岁之间，且都有良好的睡眠作息习惯（体动记录仪记录每天平均上床时间：11：01 pm；平均起床时间：7：18 am），没有任何精神躯体疾病史以及任何SD禁忌疾病。

2.2 SD对警觉性的影响 重复测量ANOVA发现，SD后被试的PVT中位反应时（intermediate RT）及走神次数（lapses）显著增加（图1A、B），发现天数因素存在主效应（RT：F1，40=8.05，P=0.007；laps⁃es：F1，40=15.67，P＜ 0.001），提示与基线（d2）相比，SD第2天（d3）出现显著的PVT中位反应时及走神次数的增加。进一步标注40 h SD期间每个个体的PVT走神次数，阐明PVT走神次数随SD时间延长的动态变化（图1C），结果发现几乎所有的被试从零点（12：00 am）直到SD结束时，PVT走神次数都显著增加，提示持续的SD导致警觉性表现的不稳定。为了与血清学指标匹配，分析基线，24 h SD后和SR后8：00 am的PVT数据（图2A、B），发现PVT的中位反应时（F1.52，30.42=13.85，P＜0.001）及走神次数（F1.43，28.66=13.26，P＜ 0.001）经过SD后3个时间点差异均有统计学意义。多重比较发现，与基线相比，经过24 h的SD，中位反应时及走神次数都显著增加（intermediate RT：P=0.002；lapses：P=0.001），提示被试警觉性表现显著受损，且经过8 h SR后（d4）与基线相比差异仍有统计学意义（intermediate RT：P=0.002；lapses：P=0.011）。

表1 人口学信息及临床一般资料Tab.1 Participant demographics and clinical characteristics（n=21）±s

表1 人口学信息及临床一般资料Tab.1 Participant demographics and clinical characteristics（n=21）±s

参数年龄（年）性别（男%）BMI（kg/m2）MEQ腰臀比睡眠效率（%）#结果22.33±0.35 11（52.40）21.74±0.44 57.29±1.13 0.80±0.01 86.29±1.12参数PSQI HAMD HAMA ESS FFS总睡眠时间（min）#结果2.67±0.27 1.38±0.33 1.71±0.29 3.67±0.50 5.57±0.54 428.24±7.01

图1 PVT反映的睡眠剥夺导致的被试警觉性连续变化Fig.1 Effects of sleep deprivation on alertness，reflected by performance on the PVT

2.3 睡眠剥夺对于血清学指标的影响 重复测量ANOVA显示3个时间点下的Orexin⁃A水平存在显著差异（F2，40=3.66，P=0.035；图2C），多重比较发现与基线相比，24 h SD后，血清Orexin⁃A水平（P=0.023）显著升高，且在8 h SR后与基线水相比差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.4 警觉性变化与Orexin⁃A变化的关系 为了探索SD相关警觉性变化与血清标志物之间的关系，评估了PVT参数变化和血清Orexin⁃A浓度变化之间的关系。Pearson相关分析发现：SD后血清Orexin⁃A水平（ΔOrexin⁃A）增加与PVT中位RT增加（ΔIntermediate RT）之间呈负相关（r=-0.53，P=0.014；图2D）。

3 讨论

睡眠是生物机体的本能行为之一，对机体具有非常重要的意义，SD是研究睡眠功能与发生机制的重要方法。本实验利用睡眠医学常用的SD范式研究急性SD对认知警觉性的影响并进一步探究其可能的机制。众所周知，一定的警觉性及注意力，对完成复杂的认知过程是极其重要的，是完成其他更高层次认知功能的基础。此外，机体警觉性也是SD最能持续和显著影响的认知能力之一［10］。在正常睡眠情况下，健康人在正常清醒时间里警觉性是保持相对稳定的，且只要保证足够的睡眠，在正常生理节律情况下，警觉性的波动也是微不足道的，且这种波动也只有在十分敏感的指标下才能检测到。SD期间评价警觉性最常用的方法是PVT［11］。PVT的反应时间（RT）及走神次数等指标对SD或慢性睡眠限制导致的警觉注意力下降非常敏感且检测效度高、学习效应小，已成为评估SD对认知警觉影响的“金标准”［10］。有研究证明当连续觉醒的时间超过16 h时，大多数人都开始出现RT显著增加等PVT表现明显受损的现象，且随着觉醒时间的持续会继续恶化［12］。本研究发现，随着SD时间的延长，人体的警觉性稳态遭受破坏，主要表现为反应时及走神次数都显著增加，且短期的恢复睡眠不能完全恢复，这就提示人们在急性SD后即使经历了短暂SR也不应继续从事对注意警觉性有要求的工作，比如驾驶、登高及高危车床等。但目前关于SD如何去影响这种节律以及其受损的潜在生理机制还不清楚。Orexin-A是一种下丘脑特定神经元分泌释放的神经肽且可以迅速通过血脑屏障进入到外周血里，在饮食摄入和能量代谢稳态方面起重要作用，且参与睡眠与觉醒状态的调控具有促进和维持醒觉的作用［8-9］。通过对发作性嗜睡症的患者的脑组织进行研究发现，相比于正常人，患者下丘脑中食欲素神经元数量明显减少（85% ～95%）［13］。此外，通过评估正常人及发作性嗜睡症患者脑脊液Orexin⁃A溶度发现，相比正常人，患者脑脊液中几乎无法检测到Orexin⁃A，这就提示了食欲素神经元分泌的Orexin⁃A可能与睡眠觉醒调控有关［14］。近年来，一些研究还发现，Orexin⁃A在缓解SD引起的认知受损方面也起重要作用［9］。这就提示SD后机体食欲素-A的水平与认知行为学的改变可能存在某种联系，且SD会导致小鼠相关脑区食欲肽神经元的Orexin释放及活性的显着增加［14］。本研究也发现SD后Orexin⁃A水平显著增加。此外，已有研究发现食欲肽神经元的数量可以影响警觉性及持续注意力任务表现［15］。本研究发现SD导致的Orexin⁃A水平的变化与PVT中位反应时变化之间呈负相关，这就提示越高的Orexin⁃A水平变化会导致越小的PVT中位反应时受损。这可能由于在清醒期间，Orexin合成神经元通常是活跃的，反过来，这些神经元的激活也会增加觉醒［16］，SD导致的持续清醒时间延长，会导致这些神经元的Orexin合成与维持觉醒之间的平衡被破坏，在同等的PVT表现下，越高的Orexin⁃A分泌变化，提示相应神经元持续觉醒的调节能力越强，警觉性表现越稳定［15］。这一发现可能为后续进一步研究SD导致的认知警觉性受损的机制提供参考。

图2 睡眠剥夺及睡眠恢复对PVT参数及血清Orexin⁃A水平的影响及两者相关性Fig.2 Effects of sleep deprivation and sleep recovery on PVT parameters and serum Orexin⁃A level and their correlation

综上所述，本研究通过严格控制SD及被试纳入的条件，以探究SD/SR对警觉性和血清Orexin⁃A水平变化的影响及两者相关性。发现SD会破坏人体正常的警觉性节律，且这种警觉性受损与血清Orexin⁃A的水平有关，但Orexin⁃A是如何影响警觉性的表现及其具体神经生物学机制还需要进一步探索。本研究希望能为后续研究SD导致的认知受损和警觉性下降的可能机制提供参考及为临床可能的SD导致认知受损生物标志物和治疗靶标。本研究也存在不足之处：由于实验条件限制，本研究未能与PVT测试进行匹配静脉多次采血，进一步深入探究警觉性节律与血清Orexin⁃A浓度之间的关系。此外，研究的样本量也太小。本课题组后续将进行外周给予Orexin⁃A能否缓解SD所致的警觉性受损的大样本研究来进一步验证本的实验发现。