高东奇 李青山 张晶晶 李富博 白璐

承德医学院附属医院南院肿瘤科（河北承德 067000）

肺癌是全世界常见的恶性肿瘤之一，其总的发病率和死亡率居恶性肿瘤首位，并呈逐年上升趋势，严重威胁人类健康［1-2］。临床上对肺部疾病患者一般进行影像学检查，虽然能够对肺部疾病的诊断提供重要参考，但对于区分肺癌和肺良性疾病存在局限，主要是由于肺癌与肺良性疾病的早期症状相似，这导致肺癌早期诊断率较低，使患者错过了最佳治疗时机，致使肺癌患者预后不佳、死亡率升高等，故肺癌的早期诊断具有重要意义［3］。肺癌血清生物标志物检查是一种有效的肺癌早期诊断手段，该方法具有简单、快速、无创、低成本等优点，但传统标志物的灵敏度和特异性存在一定局限［4］，因此寻找新的标志物对于提高肿瘤诊断的敏感性具有极其重要的提示作用。血清骨桥蛋白（osteopontin，OPN）作为一类具有多种生物学功能的细胞因子，存在于不同的组织和细胞中，其在细胞趋化、黏附和迁移、免疫调节、信号转导、抑制细胞凋亡等过程中均发挥重要作用；细胞质胸腺激酶（cytoplasm thymidine kinase，TK1）是DNA前体物质合成的限速酶之一，可催化胸腺嘧啶核苷转变成单磷酸胸腺嘧啶，与细胞增殖生长有着密切的联系；DKK1（Dickkopf⁃1，DKK1）已经证实在肺癌、大肠癌、胃癌、子宫内膜癌等多种肿瘤组织以及血清样本中异常表达。因此，本实验通过采用酶联免疫吸附试验（ELISA）和免疫印迹增强化学发光法检测不同人群中血清中OPN、TK1和DKK1含量，并采用Logistic回归和受试者工作特征曲线（ROC曲线）评价血清OPN、TK1和DKK1单独或联合检测在肺癌早期诊断中的临床应用价值，及其区分肺良性疾病和肺癌的潜在价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取我院2014年7月至2016年7月收治的80例肺癌患者（肺癌组）作为研究对象，所有肺癌患者均经病理学检查确诊，另选取80例肺良性疾病患者（肺良性疾病组）和60例健康人群（健康对照组）作为研究对象，所有研究对象均排除其他类型肿瘤、心、肝、肾等重要脏器疾病，并签署知情同意书。肺癌组男53例，女27例，年龄31～69岁，中位年龄56岁，其中小细胞肺癌12例，腺癌38例，鳞癌27例，大细胞癌3例；肺良性疾病组男51例，女32例，年龄28～71岁，中位年龄54岁，其中炎性假瘤15例，结核瘤49例，错构瘤16例；健康对照组男38例，女22例，年龄27～65岁，中位年龄53岁，组别间性别比、年龄等一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

1.2 方法 所有静脉血样本均于早晨空腹抽取，将血清于-20℃冰箱中保存待用，所有肺癌或肺良性疾病患者血液样本均于治疗前采集。ELISA法检测血清OPN、DKK1含量，ELISA试剂盒由武汉伊莱瑞特生物科技有限公司提供，免疫印迹增强化学发光法检测TK1含量，试剂盒由华瑞同康生物技术有限公司提供，操作步骤严格按照说明书进行。

1.3 统计学方法 采用SPSS 19.0软件进行分析，数据以中位数及四分位数［M（P25，P75）］表示，两组间比较采用Mann⁃WhitneyU检验。采用Logistic回归模型计算个体预测概率值作为联合诊断新变量，并建立ROC曲线，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 血清OPN、TK1和DKK1含量的比较 健康对照组和肺良性疾病组血清中OPN、TK1和DKK1含量差异无显著性（P＞0.05）；与健康对照组或肺良性疾病组比较，肺癌患者血清中OPN、TK1和DKK1含量均显著升高，差异具有统计学意义（P＜0.05），见表1。

2.2 OPN、TK1和DKK1的Logistic回归分析 对肺良性疾病组和肺癌组结果进行Logistic回归分析，结果表明，血清OPN、TK1和DKK1含量均与肺癌发生密切相关（P＜0.05），分析结果见表2。使用SPSS软件联合三者建立二元Logistic回归模型，并联合三者生成新变量—预测概率值，作为三者联合区分肺良性疾病和肺癌的诊断指标。

2.3 ROC曲线分析结果 ROC曲线结果表明，血清OPN、TK1和DKK1均具有一定的肺癌诊断价值（P＜0.05），具有区分肺良性疾病和肺癌的能力，三者的诊断价值由高到低依次为DKKA、TK1和OPN，但三者之间差异无统计学意义（P＞0.05）；以最大Youden指数作为准确度评价指标时，TK1的灵敏度较低，但其特异性最高，OPN和DKK1对应的灵敏度和特异性比较接近。当以三者联合生成的预测概率值作为新诊断指标时，三者联合检测对应的ROC曲线下面积达0.906（0.860，0.951），显著高于三者单独检测的诊断价值（P＜0.05），且同时提高灵敏度和特异性。见表3和图1。

表2 OPN、TK1和DKK1的Logistic回归分析Tab.2 Logistic regression analysis of OPN，TK1 and DKK1

表3 各肺癌诊断指标的ROC曲线结果分析Tab.3 The diagnostic indicators of lung cancer ROC curve analysis

图1 各肺癌诊断指标的ROC曲线图Fig.1 ROC curve of lung cancer diagnostic indicators

3 讨论

目前肺癌确诊的金标准为病理学检查，但由于检查设备受限、创伤大、成本高、患者顺应性差等缺陷，很难大范围推广应用，导致肺癌患者被发现时多为中晚期，致使我国肺癌死亡率始终居高不下，因此，适合大范围应用的血清生物标志物检查成为一种早期诊断肺癌的重要手段［5］。

OPN作为一种分泌型磷酸化糖蛋白，具有多种生物学活性，能够促进细胞的趋化、黏附和迁移，与恶性肿瘤的增殖、侵袭及转移等过程密切相关［6］。OPN作为促进肺癌血管生成的一种细胞因子，在肺癌的发生、发展和转移过程中起着极其重要的作用［7］。OPN在正常人群血液中呈低表达，但在肺癌患者外周血中高表达，并且血清OPN表达水平与肺癌患者预后不佳［8］、临床病理特征［9］呈高度正相关，并且对肝细胞癌［10］、卵巢癌［11］等具有一定的诊断价值，有望成为一种无创的肺癌筛查的生物标志物，但国内关于其对肺癌诊断价值的研究鲜有报道。TK1是一种新型的细胞增殖特异性标志物，与细胞分裂增殖密切相关，是DNA合成期的特殊标志酶，与细胞增殖能力呈正相关，在健康人群血清中TK1表达极低，当机体发生恶性肿瘤时，细胞增殖速度异常增加，TK1含量明显升高，该特点为其在早期肺癌诊断中的应用奠定了基础［12-13］。临床研究表明，血清TK1含量升高是肺癌预后不佳的重要因素，并且在肺癌化疗前期TK1含量增加与治疗失败和较差的总体生存率高度相关［14］。研究表明，血清TK1在乳腺癌、结直肠癌、胃癌等患者中异常升高，对于肿瘤检测具有较高特异性，可有效提高其他肿瘤筛查指标的肿瘤检出率。DKK1为一种分泌型糖蛋白，主要通过抑制Wnt信号通路影响细胞凋亡、肿瘤细胞侵袭和转移等，在肿瘤发生发展过程中起到重要作用［15］。目前，血清DKK1检测用于肿瘤筛查以肝细胞癌［16］和胰腺癌［17］的研究为主，有研究表明，肺癌患者血清中DKK1含量异常升高［18］，有望成为肺癌诊断的新的血清学指标，但国内外关于评价血清DKK1对肺癌诊断价值的研究相对较少，缺乏足够的人体研究数据支持，因此，本研究通过比较血清DKK1在健康人群、肺良性疾病患者和肺癌患者中的含量，并对其诊断价值进行评价，希望为应用血清DKK1诊断肺癌提供参考。

本研究结果表明，肺癌患者血清中OPN、TK1和DKK1含量明显高于健康人群或肺良性疾病患者，提示血清OPN、TK1和DKK1检测具有筛查肺癌的可能性。由于健康人群和肺良性疾病患者之间各指标差异均无显著性，且临床早期区分肺良性疾病和肺癌的意义重大，故本文只针对肺良性疾病和肺癌的区分展开进一步探讨。通过Logistic回归对肺良性疾病和肺癌患者的数据进行分析，结果表明血清OPN、TK1和DKK1表达水平与肺癌发生关系密切，并进一步得出三者联合的预测概率值，作为三者联合区分肺良性疾病和肺癌的诊断指标。ROC曲线分析结果表明，血清OPN、TK1和DKK1单独检测均具有一定的肺癌诊断价值，其中TK1的特异性可高达92.77%，但灵敏度偏低，而联合检测的诊断价值显著高于三者单独诊断，并能够同时提高肺癌诊断的灵敏度和特异性，灵敏度和特异性分别达到77.5%和93.98%，这可有效降低三者单独诊断肺癌时发生误诊或漏诊的情况。综上所述，血清OPN、TK1和DKK均可用作临床筛查肺癌的指标，且三者联合检测具有较高的临床诊断价值，可以提高肺癌早期诊断的特异性和敏感性，对于区分肺癌和肺良性疾病具有重要价值。但是，这也是笔者早期粗浅的研究结果，目前也只是完成了对不足100例患者的检测，还仍需要更大样本量的数据来证实三者联合检测可以提高肺癌早期诊断的实用性及有效性。同时，由于受到本科室收治对象为肺病患者的局限性，未能与其他类型肿瘤进行对照研究，故笔者下一步将尝试于其他肿瘤科室合作进行深入研究。