庄帝钱 梁翠琼 赵芳

手足口病是儿科常见的流行性传染病, 尤以肠道病毒EV71感染最多, 除伴发低热、皮疹等手足口病常见临床表现外, 易导致中枢神经系统损伤, 病死率较高［1］。但目前对于手足口病的发生、发展机制尚未阐明。既往研究显示, 多种病毒性感染疾病进展都有细胞免疫系统的参与, 免疫细胞的异常激活与疾病严重程度有关［2］。对于EV71型手足口病, T淋巴细胞在其发生发展过程中扮演重要角色。本研究通过比较不同临床分期EV71型手足口病患儿的外周血T淋巴细胞活化水平, 以期探讨EV71型手足口病患儿外周血T淋巴细胞活化状态与病情进展的相关性。

1 资料与方法

1. 1 一般资料 选取2015年6月~2017年6月本院感染科收治的经RT-PCR定性法检测粪便呈 EV71病毒核酸阳性的手足口病患儿140例为研究对象。纳入标准：①符合中华人民共和国卫生部手足口病防治指南(2010版)关于手足口病的诊断标准［3］；②年龄6个月~6岁；③患儿受试前需征得家长同意, 并由患儿家长签署知情同意书。排除标准：①合并单纯疱疹病毒、呼吸道合胞病毒、EB病毒等感染者；②合并结核、肿瘤等引起免疫异常的疾病者；③近期应用免疫抑制剂或免疫增强剂者；④合并严重心、肝、肺、肾等重要脏器功能不全者。140例手足口病患儿依照中华人民共和国卫生部(现卫计委)肠道病毒EV71型感染重症病例临床救治专家共识(2011版)临床分期标准［4］将其分为普通病例组(60例)、重型病例组(45例)、危重型病例组(35例)。选取同期门诊健康体检儿童50例为对照组, 均符合条件如下：①年龄6个月~6岁；②体检结果均正常, 无心、肝、肺、肾等重要脏器疾病；③近期无呼吸道、消化道等感染病史；④无手足口病等传染病接触史。普通病例组男34例, 女26例,年龄7个月~5岁, 平均年龄(2.75±1.03)岁；重症病例组男23例, 女22例, 年龄6个月~5岁, 平均年龄(2.71±1.09)岁；危重症病例组男19例, 女16例, 年龄9个月~6岁, 平均年龄(2.83±1.05)岁；对照组男25例, 女25例, 年龄1~6岁,平均年龄(2.78±1.07)岁。四组研究对象性别、年龄等一般资料比较差异无统计学意义(P＞0.05), 具有可比性。本研究已经医院伦理委员会审批通过。

1. 2 实验方法 所有儿童均于清晨空腹取肘静脉血 2 ml, 置于含有肝素钠抗凝管内, 颠倒混匀, 并于6 h内进行流式细胞仪检测, 对于无法6 h内检测样本, 于4℃保存备检。取肝素化外周全血100 μl置于专用试管内, 加入CD8-FITC/CD3-PerCP/CD4-APC、HLA-DR-PerCD/CD4-ADC /CD8-FITC 或CD38-PerCD/CD4-ADC/CD8-FITC, 每种抗体加10 μl, 震荡混匀后室温避光孵育20 min, 加入溶血素溶血处理10 min,1500 r/min离心5 min收集细胞, PBS洗涤并重悬细胞, 上机检测, 每个样本至少收集1×104个细胞。流式细胞仪采用美国BD公司 FACS Calibur 流式细胞仪进行, 相应荧光标记单克隆抗体均由自美国BD公司生产, 并采用Cell Quest软件收集并分析T淋巴细胞亚群分布及其活化状态。

1. 3 观察指标 比较四组研究对象外周血T淋巴细胞亚群分布情况及T淋巴细胞活化状态, 分析手足口病病情进展与T淋巴细胞活化的相关性。

1. 4 统计学方法 采用SPSS20.0统计学软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差(±s)表示, 采用t检验；计数资料以率(%)表示, 采用χ2检验；相关性采用Pearson相关性分析。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2. 1 四组研究对象外周血T淋巴细胞亚群分布情况比较EV71型手足口病患儿各组外周血CD3+T淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞绝对计数及CD4+/CD8+比值显著低于对照组(P＜0.05)；普通病例组患儿外周血CD3+T淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞绝对计数及CD4+/CD8+比值明显高于重型病例组及危重型病例组(P＜0.05)；重型病例组外周血CD3+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞绝对计数及CD4+/ CD8+比值明显高于危重型病例组(P＜0.05)。见表1。

2. 2 四组研究对象T淋巴细胞活化状态比较 EV71型手足 口 病 患 儿 各 组 HLA-DR+CD4+、HLA-DR+CD8+、CD38+CD4+、CD38+CD8+活化亚群百分比显著高于对照组(P＜0.05)；普 通 病 例 组 患 儿 HLA-DR+CD4+、HLA-DR+CD8+、CD38+CD4+、CD38+CD8+活化亚群百分比明显低于危重型病例组,且重型病例组HLA-DR+CD4+、CD38+CD8+活化亚群百分比明显低于危重型病例组, 差异具有统计学意义(P＜0.05)；普通病例组患儿HLA-DR+CD4+、CD38+CD8+活化亚群百分比明显低于重型病例组(P＜0.05)。见表2。

表1 四组研究对象外周血T淋巴细胞亚群分布情况比较( ±s)

表1 四组研究对象外周血T淋巴细胞亚群分布情况比较( ±s)

注：与对照组比较, aP＜0.05；与重型病例组比较, bP＜0.05；与危重型病例组比较, cP＜0.05

组别 例数 CD3+T淋巴细胞(%) CD4+T淋巴细胞(%) CD8+T淋巴细胞(%) CD4+/CD8+普通病例组 60 59.50±9.72abc 29.65±8.67abc 22.07±10.81abc 1.32±0.16abc重型病例组 45 44.72±10.62ac 21.55±7.43a 17.93±6.35ac 1.20±0.18ac危重型病例组 35 38.40±7.46a 19.54±5.44a 14.76±5.03a 1.07±0.22a对照组 50 68.95±8.34 44.69±10.56 27.05±8.12 1.65±0.23

表2 四组研究对象T淋巴细胞活化状态比较( ±s, %)

表2 四组研究对象T淋巴细胞活化状态比较( ±s, %)

注：与对照组比较, aP＜0.05；与重型病例组比较, bP＜0.05；与危重型病例组比较, cP＜0.05

组别 例数 HLA-DR+CD4+ HLA-DR+CD8+ CD38+CD4+ CD38+CD8+普通病例组 60 18.64±4.76abc 17.70±4.96ac 7.75±2.33ac 53.84±10.62abc重型病例组 45 28.12±5.63ac 18.97±4.72a 8.74±3.41a 68.75±8.93ac危重型病例组 35 33.42±6.04a 20.34±4.55a 9.65±3.76a 74.60±7.86a对照组 50 7.45±2.67 12.58±5.43 5.59±2.36 27.35±5.76

2. 3 手足口病病情进展与T淋巴细胞活化的相关性分析经Pearson相关性分析发现, HLA-DR+CD4+、CD38+CD8+活化亚群百分比与手足口病病情进展呈极强正相关(r=0.878、0.867,P＜0.05), HLA-DR+CD8+、CD38+CD4+活化亚群百分比与手足口病病情进展呈中等程度正相关(r=0.415、0.525,P＜0.05)。见表 3。

表3 手足口病病情进展与T淋巴细胞活化的相关性分析

3 讨论

目前, EV71已取代柯萨奇病毒A16型(CoxA16)成为手足口病的主要致病病原体, 占到手足口病总发病人数的80%以上［5］。EV71感染后主要在肠道内复制, 患儿表现出发热、疱疹样皮损等症状, 随着病毒感染的进程, 患儿开始出现脑干脑炎、无菌性脑膜炎、脊髓灰质炎样麻痹等神经系统并发症, 手足口病重症化, 进一步发展, 可能出现肺水肿等呼吸系统并发症以及神经系统的永久性损伤, 最终导致患儿死亡［6-8］。但目前对于EV71型手足口病的发病机制尚不明确,临床仍缺乏特异、高效的抗病毒药物。因此, 探讨EV71型手足口病发生、发展的影响因素, 对重症病例提供早期预警指标及新的治疗方向具有重要意义。

动物实验发现, 感染EV71后T淋巴细胞数量缺乏的小鼠更易发展为重症病例［9］, 提示细胞免疫系统在手足口病发病过程中发挥重要作用。对于小儿而言, 天然免疫系统尚未发育成熟, 其免疫机制以T淋巴细胞为主。按照细胞表面抗原差异, T淋巴细胞分为CD4+、CD8+细胞亚群, 其中CD4+T细胞为免疫辅助性细胞, 促进体液免疫和细胞免疫；CD8+T细胞为细胞毒性细胞或抑制性细胞, 抑制免疫反应,二者的动态平衡共同维持机体免疫功能的稳定［10,11］。本研究结果显示, EV71型手足口病患儿各组外周血CD3+T淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞绝对计数及CD4+/CD8+比值显著低于对照组(P＜0.05)；普通病例组患儿外周血CD3+T淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞绝对计数及CD4+/ CD8+比值明显高于重型病例组及危重型病例组(P＜0.05)；重型病例组外周血CD3+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞绝对计数及CD4+/ CD8+比值明显高于危重型病例组(P＜0.05)。提示手足口病患儿存在细胞免疫功能下降且存在免疫紊乱。

既往研究显示, 在人类免疫缺陷病毒(HIV)、EB病毒、乙型肝炎病毒(HBV)等多种病毒感染时均出现T淋巴细胞异常活化, 且其与病毒载量间呈正相关［12,13］。这提示手足口病患儿也可能存在T淋巴细胞的异常活化。HLA-DR和CD38是T淋巴细胞活化的标志物。HLA-DR是人类主要组织相容性复合体MHC-Ⅱ类分子的抗原之一, 用于病原体有效抗原成分的提呈, 从而激活T淋巴细胞［14］。CD38是一类单链跨膜糖蛋白, 与T淋巴细胞协同刺激信号的传递及诱导特定细胞因子的生成有关, 从而促进T淋巴细胞的激活［15］。本研究结果显示, EV71型手足口病患儿各组HLADR+CD4+、HLA-DR+CD8+、CD38+CD4+、CD38+CD8+活 化亚群百分比显著高于对照组(P＜0.05)；普通病例组及重型病例 组 患 儿 HLA-DR+CD4+、HLA-DR+CD8+、CD38+CD4+、CD38+CD8+活化亚群百分比明显低于危重型病例组, 且HLA-DR+CD4+、CD38+CD8+活化亚群百分比明显低于重型病例组, 差异具有统计学意义(P＜0.05)；重型病例组患儿HLA-DR+CD4+、CD38+CD8+活化亚群百分比明显低于危重型病例组(P＜0.05)。表明EV71感染可促进T淋巴细胞的激活。经Pearson相关性分析发现, HLA-DR+CD4+、CD38+CD8+活化亚群百分比与手足口病病情进展呈极强正相关(r=0.878、0.867,P＜0.05), HLA-DR+CD8+、CD38+CD4+活化亚群百分比与手足口病病情进展呈中等程度正相关(r=0.415、0.525,P＜0.05)。提示T淋巴细胞的活化与EV71型手足口病的病情进展密切相关。此外, 活化的T淋巴细胞高表达Fas/FasL, 促进T淋巴细胞的凋亡, 也解释手足口病患儿T淋巴细胞数量的降低［14］。

综上所述, EV71型手足口病患儿外周血T淋巴细胞数量显著减少, 但其活化程度增加, 且活化程度与病情进展密切相关。因此, 通过对EV71型手足口病患儿外周血T淋巴细胞激活亚群的检测, 能够判断疾病进展情况, 从而指导临床治疗, 改善患儿预后。