李鹏飞, 郝庆玲, 毕锡麟, 王 锴, 朱芷葳, 吕丽华(.山西农业大学生命科学学院；.山西农业大学动物科技学院，山西 太谷 03080)

牛卵泡的发育过程受多方面因素的调节.对卵泡发育阶段的划分也较为复杂，在1927—1986年的大量文献中，对牛卵泡发育阶段的划分一直沿用有腔卵泡生长和闭锁的概念[1].超声波监测技术的应用和发展，为无损伤监测和采集特定阶段的牛卵泡，并深入研究影响牛卵泡发育提供了条件.Romereim et al[2]通过基因芯片对牛颗粒细胞(granulesa cells, GCs)和膜细胞、大黄体细胞和小黄体细胞进行转录组检测和分析，筛选牛卵泡发育和黄体形成的调控基因；Terenina et al[3]通过高通量测序分析猪生长卵泡和闭锁卵泡GCs表达谱，筛选出1 684个调控卵泡发育的重要基因，其中包括11个调控闭锁的标记基因.牛卵泡在发育过程中，原始卵泡经募集后进入发育期，随着卵泡GCs的增殖分化，GCs增大增多，随之出现卵泡的优势化，即卵泡发育偏差期的出现.偏差期的出现将牛卵泡发育过程分为两个阶段，即偏差期前和偏差期后的卵泡，偏差期前的第二大卵泡(the second largest follicle at onset of predeviation, PDF2)在发育过程中可能成为优势卵泡并最终排卵，而偏差期后的第二大卵泡(the second largest follicle at onset of deviation, ODF2)随着优势化卵泡的出现，最终走向闭锁.本课题组通过Illumina平台对牛发情期内出现偏差前的最大卵泡(PDF1)、PDF2、出现偏差后的最大卵泡(ODF1)和ODF2等4个转录组进行了深度测序，对影响牛卵泡发育的基因进行挖掘[4-5]，并对CART、TEDDM1、AGTR2和CMKLR1等部分基因进行了深入研究[6-8].本试验对ODF2和PDF2进行转录组分析，深入挖掘影响牛卵泡发育的调控基因，旨在为进一步厘清基因调控对卵泡发育的影响提供参考.

1 材料与方法

1.1 试验动物及样品采集

选择6头性成熟雌性青年牛，标准饲养管理水平下同期发情处理，每12 h采用B超声波仪检测一次并详细绘制双侧卵巢各发育卵泡变化图.其中，3头牛在卵泡波出现偏差前屠宰采集PDF2；另3头牛在卵泡波出现偏差后屠宰采集ODF2.将各卵泡置于4 ℃的DPBS中待处理.

1.2 方法

1.2.1 GCs的分离及总RNA的抽提 依次将各卵泡置于盛有DPBS的平皿中，一分为二剪开卵泡并用刮刀分离GCs，弃卵泡膜；将GCs和DPBS一并转移至EP管，于2 000 r·min-1离心15 min，弃上清；添加500 μL RNAiso Plus抽提总RNA.

1.2.2 文库构建及测序 分别取各组RNA样品8 μL，Oligo磁珠富集后裂解；裂解产物作为模板，加入随机引物及一系列缓冲液合成cDNA第一链和第二链；用QiaQuick PCR kit试剂盒纯化，经EB洗脱、末端修复、加尾及5′和3′接头；电泳回收片段并进行PCR扩增，构建完整的cDNA文库；用Illumina HiSeq 2000平台测序.

1.2.3 转录组差异表达基因的筛选 参考Audic et al[9]的方法筛选差异表达基因，参数设定为：截断值≥0.5，ODF2-RPKM/PDF2-RPKM≥2，PDF2-RPKM/ODF2-RPKM≥2，FDR校正值的P<0.05，获得差异表达基因.

1.2.4 差异表达基因GO和KEGG通路分析 使用DAVID 6.7在线软件(https://david.ncifcrf.gov/)对筛选出的差异表达基因进行GO和KEGG通路分析，文本框输入基因列表，物种设定为牛，设定P<0.05，分别获得基因功能聚类和KEGG通路分析结果.

1.2.5 卵泡发育相关基因的筛选 选取KEGG通路和GO分析中的关键通路和富集基因，经基因功能查询系统GeneCards(http://www.genecards.org/)筛选与牛卵泡发育密切相关的基因.

2 结果与分析

2.1 高表达基因的筛选

转录组测序共获得35 325个基因.其中，高表达基因有15 536个(截断值≥0.5)，表1列出了表达量最高的10个基因，可见ODF2和PDF2中的高表达基因表达差异较小，表明这些高表达基因贯穿牛卵泡发育的整个过程，对维持卵泡的正常发育具有重要作用.如GSTA3参与类固醇合成过程；SERPINE2具有抑制蛋白酶活性的功能；INHA、INHBA和FST具有抑制促卵泡素分泌的作用；也有间接调控细胞凋亡的基因，如SRGN.

表1 转录组ODF2和PDF2中表达量最高的基因Table 1 The highest expression genes in ODF2 and PDF2 follicles

2.2 高差异表达基因的筛选

对高表达基因进行进一步的筛选，共发现504个差异表达基因.其中，ODF2相对于PDF2上调的差异表达基因有198个；PDF2相对于ODF2上调的差异表达基因有306个.表2列出了双向表达差异倍数最高的10个基因及其功能注释，其中有参与转录调控的RN5-8S1和ZKSCAN1，有参与负调控卵泡发育的神经肽CARTPT和ULBP3，也有参与免疫调控的SPP1和BOLA-N.

表2 ODF2和PDF2中高差异表达基因及其功能1)Table 2 List of high differential expression genes in ODF2 vs. PDF2 and their functions

1)-表示数据库基因功能查询无结果.

2.3 ODF2和PDF2转录组差异表达基因的GO分析

对504个差异表达基因进行GO分析，其中，350个基因获得注释，分三大类：生物过程占39.49%，细胞组分占46.96%，分子功能占13.55%(图1～3).通过GO分析可较为直观地筛选一些重要基因，如参与细胞发育的基因共有37个(图1)，其中，STK11、ARID4B、SOX4、GREM1和TGFBR3等部分基因在其他转录组的筛选中也出现过；通过调节跨膜受体蛋白激酶活性参与分子功能的基因有NTRK1、TGFBR3、KIT和EPHA2(图2)；参与胞内物质组分的基因有182个，参与细胞骨架形成的基因有39个(图3).

2.4 ODF2和PDF2转录组差异表达基因的KEGG通路分析

KEGG通路分析结果(表3)表明，差异表达基因参与10条显著富集的信号通路调节.其中在牛卵泡GCs发育调控中研究较多的通路有3条：参与PI3K-Akt信号通路调节的基因有12个，参与Wnt信号通路调节的基因有11个，参与mTOR信号通路调节的基因有4个.

图1 差异表达基因生物过程功能注释Fig.1 Biological process functional annotation of differentially expressed genes

图2 差异表达基因分子功能注释Fig.2 Molecular functional annotation of differentially expressed genes

图3 差异表达基因细胞组分功能注释Fig.3 Cellular component functional annotation of differentially expressed genes

表3 差异表达基因KEGG通路功能注释Table 3 KEGG pathway functional annotation of differentially expressed genes

2.5 卵泡发育相关基因的筛选

经KEGG通路和GO功能富集分析后，筛选直接与卵泡发育相关的功能聚类和信号通路调控基因进行GeneCards功能查询，共获得18个与卵泡发育密切相关的差异表达基因，各差异基因表达倍数及功能注释见表4.

表4 卵泡发育相关基因的筛选Table 4 Candidate genes associated with follicular development

3 讨论

近年来，高通量RNA测序技术成为转录组分析的重要工具[10]，尤其在卵巢卵泡发育和成熟的相关研究中广泛应用[11].通过全基因组转录组分析，获得许多差异表达基因编码的信号分子，如GDF9、BAX、BAD、NDUFA13、IFI6和CAV1基因对绵羊繁殖力有重要影响[12].同样，在牛卵泡发育波中，对黄体生成素波峰前后的卵泡GCs进行转录组分析，发现部分基因表达量的上调对排卵具有重要调控作用[11].这表明转录组分析技术筛选卵泡发育调控基因的应用效果较好；且Illumina测序平台具有试验误差小，重复性好的特点[13].因此，本试验通过Illumina测序技术对不同生理阶段的发育卵泡进行转录组分析，旨在进一步获得影响牛卵泡发育的调控基因.

磷脂酰肌醇3激酶—蛋白激酶B(PI3K-Akt)作为经典信号通路，其活性受类脂磷酸酶PTEN调节，PI3Ks通路参与细胞分化、增殖和凋亡功能的调节.研究发现，PI3K与下游蛋白激酶B(PKB或Akt)形成的通路对调节癌细胞增殖和存活具有重要作用[14].Ma et al[15]研究表明，雄激素通过PI3K-Akt通路磷酸化作用影响动物正常排卵.卵泡刺激素对小鼠卵泡GCs氧化性损伤具有保护作用，其机理是通过PI3K-Akt-mTOR通路的激活，使得卵泡刺激素调节的氧化诱导自噬激活，保证了卵泡GCs的存活[16].KEGG通路分析表明，有12个基因参与PI3K-Akt信号通路调节，其中，STK11、CDK6、MYC和PIK3R3通过细胞周期、增殖分化和激素分泌调节参与牛卵泡的发育过程.

mTOR是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其C末端TOR区域与PI3K催化区高度同源，mTOR通路受多种细胞信号调节，如促有丝分裂生长因子和胰岛素等[17]，参与青春期发育、促性腺激素分泌、卵泡发育和成熟的调节[18].研究表明，阻断mTOR通路可诱导小鼠有腔卵泡形成的延长[18]；张毅敏等[19]研究也表明，针刺疗法治疗小鼠卵巢功能早衰，其疗效与雌激素处理相当，作用机制可能是通过上调PI3K/Akt/mTOR信号通路中的基因或蛋白表达实现的.本试验结果表明，STK11、ULK3、PIK3R3和EIF4E2参与了牛卵泡mTOR信号通路的调节，其中，STK11、PIK3R3和EIF4E2也参与了PI3K-Akt信号通路调节，这也表明在卵泡发育的过程中，PI3K-Akt通路与mTOR通路互相交织，共同调节卵泡的发育进程.

Wnt通路是一组通过细胞表面受体将信号向胞内转导的蛋白，该通路分为经典Wnt信号通路、非经典Wnt信号通路以及Wnt/Ca2+信号通路，3条通路均是通过Wnt-蛋白配体连接卷曲家族受体激活，参与动物胚胎发育和细胞增殖[20].Hossein et al[21]研究表明，Wnt信号通路的激活直接诱导小鼠卵泡GCs的终末分化，促进卵泡成熟；Aydos et al[22]通过基因芯片技术对人体多囊卵巢综合征患者卵泡GCs和卵丘细胞表达谱进行了转录组分析，结果表明，GCs和卵丘细胞表面的Wnt信号通路受到抑制，影响卵泡和卵母细胞的成熟，进而导致疾病发生.本试验共获得11个基因参与卵泡GCs表面Wnt信号通路的调控.

4 结论

经牛卵巢ODF2和PDF2转录组分析，共获得504个差异表达基因，获得10条显著富集的信号通路可能参与牛卵泡发育的调控；筛选出18个可能与牛卵泡发育密切相关的基因.