董家书 韦美德 周格琛 邓开凤 戴盛明

三阴性乳腺癌（triple⁃negative breast cancer，TNBC）约占所有乳腺癌的10%～20%［1］，因其侵袭力强，且缺乏有效的治疗靶点，而成为预后极差的恶性肿瘤。抑癌基因的甲基化改变是三阴性乳腺癌发生发展过程中的重要事件。文献报道，PPAR⁃γ基因可通过调节Wnt信号传导通路的表达抑制乳腺癌细胞的转移［2］。PPAR⁃γ是一种由配体激活的核转录因子，参与炎症信号通路如NF⁃KB、Ap⁃1、JAK⁃sTAT，抑制促炎介质的生成［3］。有研究认为细胞内PPAR⁃γ的表达是调节性T细胞抗炎作用所必须的［4］。5⁃氮杂⁃2⁃脱氧胞嘧啶（5⁃aza⁃2'⁃deox⁃ycytidine，5⁃Aza⁃CdR）是DNA甲基转移酶特异性抑制剂，通过与DNA甲基转移酶共价键结合，抑制DNA甲基转移酶I的甲基转移活性，除去抑癌基因启动子的甲基化，解除甲基化对抑癌基因的抑制，从而使抑癌基因再表达，发挥抑癌作用［5］。本研究拟选用不同浓度的 5⁃Aza⁃CdR 作用于乳腺癌MDA⁃MB⁃231细胞系，观察该药物对乳腺癌细胞PPAR⁃γ基因甲基化情况以及转录水平，以及对该细胞凋亡的影响，为探索乳腺癌化疗药物奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试剂材料

MDA⁃MB⁃231细胞购自中科院上海细胞库；RPMI 1640培养基、无菌PBS、胎牛血清和胰蛋白酶均购自美国GIBCO公司；5⁃Aza⁃CdR购自日本sigma公司，经无菌PBS溶解后分装，-80℃保存；DNA抽提纯化试剂盒QIAamp DNA Mini Kit（货号51304），重亚硫酸氢盐转化试剂盒EpiTect Fast Bisulfite Conversion Kit（货号 59824），均购自德国凯杰生物技术（上海）有限公司；总RNA提取试剂盒Mini BEST Universal RNA Extraction Kit（货号9767），逆转录试剂盒Mir⁃X miRNA First⁃Strand Syn⁃thesis Kit（货号 68313），PCR 试剂盒 PrimeScript™RT Master Mix（货号 RR036），均购自日本 Takara公司；PCR引物由大连宝生物公司合成。

1.2 细胞培养

MDA⁃MB⁃231细胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培养液（含1%青霉素、链霉素），于5%CO2、37℃恒温培养箱培养。……