王玉浔，安雅臣，蒋艳茹

(1华北理工大学附属医院，河北唐山063000；2唐山市中医医院)

腹膜透析是终末期肾脏疾病患者行肾脏替代治疗的主要方式之一。腹膜结构、功能的正常是保证腹膜透析有效性的关键因素。腹膜间皮细胞是腹膜组织的主要组成细胞。研究表明，长期暴露在高糖腹膜透析液中，腹膜间皮细胞发生转分化，导致腹膜纤维化，最终使腹膜功能丧失[1～3]。长链非编码RNA(lncRNA)可通过基因调控参与多种疾病的发生发展过程。2016年10～11月，本研究分析了lncRNA与腹膜间皮细胞转分化的关系，旨在为进一步阐明腹膜间皮细胞转分化的分子生物学机制提供理论依据。

1 材料

SPF级C57BL/6雄性小鼠20只，7～8周龄，体质量(25±3)g，由北京实验动物有限责任公司提供。兔抗鼠转化生长因子β1(TGF-β1)、E钙黏蛋白(E-cadherin)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)一抗 ，均购自Epitomics公司(USA)。

2 方法与结果

2.2 动物分组及处理 小鼠均给予适应性喂养7天，随机分为对照组和模型组，每组10只。对照组正常饲养4周；模型组给予4.5%高糖腹膜透析液腹腔注射，每次注射剂量为1 mL/kg，1次/d，连续4周。

2.3 腹膜组织形态学观察 模型组透析4周结束时处死两组小鼠，取壁层腹膜组织，进行HE染色，观察腹膜间皮细胞及其周围结缔组织形态学改变。结果显示，对照组腹膜组织呈一层致密、光滑的薄层，覆盖一层扁平状间皮细胞，细胞连接良好，间皮下基底膜薄，与结缔组织相连，无胶原纤维组织沉积，未见毛细血管扩张、充血及炎性细胞浸润；模型组腹膜组织薄厚不均，部分间皮细胞肿胀变形甚至脱落，纤维裸露，炎性细胞增多，胶原沉积增多，间皮下致密层增厚。提示腹膜间皮细胞发生转分化。

2.4 腹膜间皮细胞转分化蛋白TGF-β1、E-cadherin、α-SMA表达检测 采用Western blotting法。取2.3制备的两组小鼠脏层腹膜组织，利用RIPA蛋白裂解液提取总蛋白，BCA法检测蛋白浓度。取约150 μg加样缓冲液100 ℃沸水煮沸5 min，充分变性后进行SDS-PAGE电泳，转膜(240 Ma，120 min)，5%脱脂牛奶常温下封闭1 h；分别加入TGF-β1(1∶3 000)、E-cadherin(1∶500)、α-SMA(1∶300)一抗，4 ℃摇床过夜；洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的二抗常温孵育2 h；再次洗膜，用ECL发光液在暗室进行压片、显影、曝光。以GAPDH为内参照，采用图像分析系统扫描确定胶片上杂交条带的相对吸光度(A)值，进行相对定量分析。结果显示，与对照组比较，模型组腹膜间皮细胞TGF-β1、α-SMA表达升高，E-cadherin蛋白表达下降，见表1；提示转分化模型建立成功。

表1 两组腹膜间皮细胞TGF-β1、E-cadherin、α-SMA蛋白表达比较

注：与对照组比较，*P<0.05。

2.5 差异表达lncRNA筛选 采用芯片技术。取2.3获得的两组小鼠脏层腹膜组织(每组3只)，TRIzol法提取组织总RNA，用Invitrogen SuperScript ds-cDNA synthesis kit合成双链cDNA，进行荧光标记并杂交漂洗，用Agilent芯片扫描仪(G2565CA)进行扫描，使用Agilent Feature Extraction(v10.7)软件对杂交图片进行分析并提取数据。使用Agilent Gene Spring软件对数据进行归一化和差异分析。差异筛选标准： fold>1.5 &P<0.05。上述工作均由北京博奥生物有限公司完成。根据芯片表达数据结果，将对照组与模型组的lncRNA表达谱进行比较，两组表达量比值在2倍以上且有统计学意义的lncRNA共757条，2倍以上上调的共311条，2倍以上下调的共446条。同时，基因芯片也检测了在腹膜细胞转分化过程中mRNA的表达谱，差异表达量比值在2倍以上且有统计学意义的mRNA共1 431条，2倍以上上调的共489条，2倍以上下调的共942条。两组表达量差异最大的前20个lncRNA见表1，表达量差异最大的前20个mRNA见表2。

表1 两组表达量差异最大的前20个lncRNA

表2 两组表达量差异最大的前20个mRNA

2.6 差异表达mRNA的GO功能注释分析 根据Gene Ontology数据库将差异表达mRNA按分子生物学功能、生物学过程和在细胞组件中的作用三个方面进行功能富集，发现在腹膜间皮细胞转分化中，差异表达的靶基因mRNA主要参与细胞膜的固有组成、细胞周边组织结构组成、炎症防御反应等。筛选出的前4位GO功能注释名称及其基因数见表3。

表3 差异表达lncRNA的GO功能注释

2.7 KEGG通路分析 利用Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)数据库对差异表达mRNA进行信号通路分析，观察在腹膜纤维化过程中发生显著变化的mRNA可能与哪些信号通路的改变有关，结果表明差异表达mRNA可能参与了真核生物翻译过程、膜蛋白合成等途径。筛选出的前4位生物学通路名称及其基因数见表4。

2.8 差异lncRNA mRNA表达检测 采用RT-PCR法对差异表达lncRNA进行验证。选择差异表达倍数较大(>5倍)，长度为500～2 000 nt，表达丰度在1 000以上的2个上调的和2个下调的lncRNA即ri|4732442J12|PX00051O23|2580、NONMMUT055611、NONMMUT002253、NONMMUT064302进行RT-PCR验证。采用ABI7500PCR仪以SYBR Green荧光染料掺入法相对定量，同时以GAPDH为内参照，采用2-ΔΔCt法计算目的基因的差异表达倍数。

表4 差异表达mRNA的KEGG通路及基因数

结果显示，模型组NONMMUT002253、NONMMUT064302相对表达量低于对照组，ri|4732442J12|PX00051O23|2580、NONMMUT055611相对表达量高于对照组(P均<0.01)。结果与芯片检测结果基本一致，表明芯片结果的可靠性。见表5。

表5 两组差异表达lncRNA mRNA相对表达量比较

注：与对照组比较，*P<0.01。

3 讨论

上皮-间质转化(EMT)是指上皮来源的细胞在特定的生理和病理条件下向间质性细胞发生转化的一种现象[4,5]。研究表明，EMT的过程包括细胞形态学和基因型改变，细胞黏附分子(如E-钙黏蛋白)表达减少，使立方上皮细胞下调或失去细胞间相互作用；上皮细胞外形演变为梭形纤维细胞形态，细胞角蛋白结构发生改变；获得了某些间质细胞或纤维原细胞的特性，如α-SMA、Vimtin蛋白、骨桥蛋白、Snail、slug及其他间质特性蛋白表达上调等[6～9]。

腹膜间皮细胞是腹膜的主要组成细胞，是维持腹膜结构完整、功能稳定和保证腹膜透析有效性的重要因素。腹膜间皮细胞发生EMT被认为是腹膜纤维化的始动环节[10,11]，其发生的初期是一个可逆的过程。早期干预腹膜间皮细胞转分化、防止腹膜纤维化及保护腹膜透析患者的腹膜功能是目前研究的重点。lncRNA是一类长度超过200个核苷酸的非编码RNA分子，随着全基因组分析技术的快速发展及广泛应用，研究人员发现lncRNA可作为人类基因组中一类重要的表观遗传调控因子，以RNA形式通过表观遗传调控、转录及转录后调控等多层面调控DNA甲基化、组蛋白修饰和染色质重构，最终调节靶基因的表达及翻译[12～16]，广泛参与细胞分化、增殖和代谢，参与多种疾病的发生及发展[17～19]。目前关于lncRNA与EMT的关系及其在肿瘤领域的重要性备受关注。研究发现，lncRNA的调控作用具有组织特异性，在不同肿瘤调控中发挥不同的作用。lncRNA可通过调控 EMT过程对细胞间连接和黏附进行调节，通过抑制EMT或促进间质-上皮转分化(MET)过程抑制或促进肿瘤发生[20～23]。

本研究借助芯片技术筛选出了与腹膜间皮细胞转分化相关的lncRNA及其下游靶基因mRNA的差异表达谱，并利用RT-PCR技术，对表达差异最为显著的4个lncRNA进行验证，其结果与芯片技术结果相一致，证明芯片结果的可靠性。

本研究首次在转录组学层面提出了lncRNA参与了腹膜透析相关性腹膜纤维化的病理生理过程。通过高通量微阵列芯片技术证实lncRNA参与了腹膜间皮细胞转分化，从而导致腹膜纤维化的发生与发展。在后续的研究中，我们将进一步分析验证差异表达lncRNA的分子生物功能及其靶基因，进一步阐明lncRNA在腹膜间皮细胞转分化中的作用，从而为临床防治腹膜透析相关性腹膜纤维化提供理论依据。