耿卫峰， 何小娜， 吴勤奋

(乌鲁木齐市解放军第474医院1神经外科， 2肾病科, 乌鲁木齐 830013)

脑出血是常见的脑血管疾病之一，由于其具有发病率、病死率和致残率高的特点，已经成为人们健康和生活质量的威胁[1-2]。由于脑出血后血肿严重毁损神经元，导致神经功能难以恢复。目前，针对脑出血的治疗以对症处理为主，如何促进病变区域遭损坏的神经元，至今尚缺行之有效的办法。脑出血治疗的主要任务是促进受损脑组织的恢复，骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)来源于骨髓的干细胞群，具有多向分化的能力，可在某种条件下分化成为神经干细胞[3]。另外，BMSCs具有多向分化潜能，易于分离培养和鉴定，获取方便，有利于开展移植研究[4]。为探讨BMSCs移植治疗脑出血的疗效，本实验通过大鼠脑出血模型的制备，采用BMSCs移植治疗脑出血，观察其对脑出血大鼠神经功能缺损的改善效果，为治疗脑出血奠定一定的实验基础和理论依据，以期为脑出血的临床治疗提供一定的参考依据。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组6周龄大小的雄性SD大鼠1只，用于提取骨髓培养BMSCs。体质量200～250 g的雄性SD大鼠45只，按随机数字表法分为假手术组(立体定位穿刺但不注入胶原酶，n=15)、脑出血模型组(n=15)和BMSCs移植组(n=15)，每组15只，46只大鼠由新疆医科大学实验动物中心提供。

1.2实验材料DMEM/F12培养液(Gibico公司)，胎牛血清(FBS，Gibico公司)，0.25%胰蛋白酶(Sigma公司)，磷酸缓冲盐溶液(PBS，Hyclone公司)，白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、酶联免疫吸附实验(ELISA)检测试剂盒(晶美生物工程有限公司)，超净工作台(北京半导体设备一厂)，细胞培养皿、细胞培养瓶(康宁，美国)，台式离心机(北京医用离心机厂)。

1.3BMSCs分离培养[5]采用颈椎脱臼法处死大鼠，无菌条件下取出双侧股骨、胫骨，去除骨两端暴露骨髓腔，用DMEM/f12培养液反复冲洗骨髓腔，尽可能收集骨髓液，制成单个核细胞悬液。之后，以2×105/L的密度接种在25 mL培养瓶中，置于37℃、5%的CO2培养箱中，3 d以后将未贴壁细胞去除，以后每2～3天换液。倒置显微镜下观察细胞贴壁生长情况，单层贴壁细胞接近80%融合时，进行细胞传代，用胰酶消化收集第3代骨髓间充质干细胞悬液，作为移植细胞用。

1.4大鼠脑出血模型制备脑出血模型组和BMSCs移植组大鼠首先进行脑出血模型的制备，参考文献[6]，采用胶原酶注入脑内诱导脑出血的方法，建立大鼠脑出血模型。SD大鼠术前禁食8 h，4%水合氯醛(1 mL/100 g)腹腔麻醉，手术期间自主呼吸，将其置于立体定位仪上，局部消毒，切开头皮，30%双氧水腐蚀骨膜，暴露前囟及冠状缝。在前囟前0.2 mm，右3.0 mm处用牙科钻钻一直径约1 mm的圆孔，用微量注射器缓慢注射Ⅰ型胶原酶2 μL (浓度0.125 U/μL)，沿孔垂直进针至硬膜下6.0 mm处，5 min注射完，留针2 min，缓慢退针至硬膜下3 mm，停针2 min后全退出颅外，用骨腊封闭颅孔，缝合皮肤，动物清醒后正常饲养。术后24 h，进行Bederson评分，对神经功能评分≥1分以上为造模成功。假手术组立体定向穿刺，但不注入胶原酶，仅注入等量生理盐水。

1.5干预方法脑出血大鼠模型制备后48 h，将造模成功的大鼠分为脑出血模型组和BMSCs移植组，BMSCs移植组大鼠麻醉固定，在造模时原骨孔处皮肤垂直进针，在进入5 mm后缓缓推入BMSCs悬液10 μL(约1×105个BMSCs细胞)，留针10 min后缓慢拔针。脑出血模型组在同样部位注入等量的生理盐水，假手术组不进行干预处理。

1.6指标检测方法

1.6.1 神经功能评分 以移植组移植完毕为计算时间点(0 h)，移植后1、3、7和14 d进行，假手术组和脑出血模型组在相同时间点进行评分。Bederson评分0分：无神经损伤症状；1分：悬尾实验不能完全伸展对侧前爪；2分：前肢抵抗对侧推力能力下降；3分：向对侧转圈。

1.6.2 IL-6和TNF-α的检测 移植后1、3、7和14 d进行腹腔麻醉，取左股动脉血1 mL，4℃、3 000 r/min离心，5 min取上清液，ELISA法测定每组大鼠血清中IL-6、TNF-α的水平。

2 结果

2.1实验动物情况假手术组15只SD大鼠均存活，脑出血模型组大鼠30只，经Bederson评分，有28只大鼠评分≥1分，即28只大鼠脑出血模型制备成功，14只BMSCs移植组大鼠经BMSCs移植后也无死亡，进入结果分析。

2.2各组大鼠神经功能评分采用Berdson评分标准对各组大鼠神经功能进行评分，假手术组未出现神经功能缺损的表现。大鼠脑出血模型制备完成后，于术后1 d开始出现神经功能缺损的表现，各时间点神经功能评分高于假手术组(P<0.05)，第3天时达高峰。其中BMSCs移植组较脑出血模型组在术后7和14 d时评分低，差异有统计学意义(P<0.05)。BMSCs移植组7和14 d时神经功能评分较1和3 d时明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)，脑出血模型组各时间点神经功能评分变化不大，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 各组个时间点神经功能评分 分)

注：与脑出血模型组比较，*P<0.05；与假手术组比较，#P<0.05。

2.3各组大鼠IL-6和TNF-α水平的比较各组在第1天时IL-6的水平差异无统计学意义，3 d时，BMSCs移植组和脑出血模型组IL-6水平高于假手术组，并且BMSCs移植组IL-6水平更高，明显高于脑出血模型组，经比较差异有统计学意义(P<0.05)。BMSCs移植组IL-6水平在3 d时达高峰，之后开始出现下降趋势，但各个时间点IL-6水平均高于脑出血模型组和假手术组，经比较差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

在各个时间点，TNF-α水平差异有统计学意义(P<0.05)，BMSCs移植组TNF-α水平逐渐降低，在各个时间点TNF-α水平均低于脑出血模型组，经比较差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表2 各组大鼠血清IL-6水平的比较

注：与脑出血模型组比较，*P<0.05；与假手术组比较，#P<0.05。

表3 各组大鼠血清TNF-α水平的比较

注：与脑出血模型组比较，*P<0.05；与假手术组比较，#P<0.05。

3 讨论

随着干细胞的发现和移植研究的不断深入，为脑出血的治疗开辟了一条崭新的途径。间充质干细胞于1970年首次由Rriedenstein从骨髓抽取物培养的附壁细胞中分离出来，具有强大的增殖能力和多向分化潜能；其来源于中胚层，是一种多潜能干细胞。由于其可取患者自身骨髓，且分离培养比较容易；另外，可以实现体外扩增，且同种移植不存在伦理学问题，便于应用临床。本实验通过BMSCs移植治疗脑出血，探讨BMSCs对脑出血大鼠神经功能缺损的改善及对大鼠血清中IL-6及TNF-α水平的影响，以期为临床试验奠定基础。

闫禹等[7]通过立体定向及体内注入胶原酶法成功制作脑出血模型，采用mNSS(modified limb neurological severig scores)评分及MLPT(modified limb plauing test)评分评价大鼠神经功能缺损和恢复情况，结果显示，大鼠造模后1～3 d为神经功能缺损的症状体征的高峰期，之后开始恢复。本研究参考其实验方法制备大鼠脑出血模型，采用Bederson评分[8]对大鼠神经功能进行评分，实验结果显示，假手术组各时间点均无神经功能缺损的表现。大鼠造模后神经功能出现缺损的表现，明显高于假手术组，且平均分均>1分，提示大鼠脑出血模型制备成功。BMSCs移植组大鼠第3天时神经功能评分明显低于脑出血模型组，在行为学治疗方面，BMSCs移植在大鼠脑出血模型中其治疗作用，与文献研究结果一致[5]。

目前，BMSCs移植途径主要包括脑内立体定向注射、静脉注射或动脉细胞悬液注射方式。静脉注射侵袭性小，但一部分的BMSCs可能会经过肺循环丢失。因此，要达到移植治疗的目的，就需要数量更多的BMSCs细胞，且静脉推注有引起栓塞的危险[9]。本研究采用立体定向装置仪向脑局部注射，增加了注射精准性，节约了BMSCs细胞的植入数量。

IL-6是由T、B淋巴细胞及单核细胞产生的细胞因子。有报道显示，机体血清IL-6水平参与脑出血的发生，其与脑出血患者的出血量及神经损伤程度有关。IL-6能激活血管内皮细胞与中性粒细胞，使炎症细胞向神经组织转移，大量弹性蛋白酶及活性因子的释放会对神经及血管内皮细胞造成损害。本研究显示，BMSCs移植组IL-6水平在术后3 d时达高峰，之后开始出现下降趋势，但各个时间点IL-6水平均高于脑出血模型组和假手术组，经比较差异有统计学意义(P<0.05)，提示BMSCs移植能够显著提高血清中IL-6水平，减轻炎症反应，

TNF-α可参与细胞的增殖和凋亡，是一种多效性细胞因子，本研究对BMSCs移植后TNF-α水平进行检测，初步探讨BMSCs移植后可能的抗炎机制，本研究结果发现，在BMSCs干预后的不同时间点，移植组和脑出血组TNF-α水平在术后1 d时达到峰值，随后呈下降趋势，假手术组各时间点TNF-α水平低于BMSCs移植组和脑出血模型组，脑出血组与BMSCs移植组间比较，BMSCs移植组TNF-α水平低于脑出血组，研究结果提示，假手术组大鼠未发生炎症反应，所以TNF-α水平较低，移植组和脑出血组TNF-α水平升高，提示神经功能的损害与炎症反应相关，而移植组BMSCs水平较脑出血组下降，提示BMSCs能明显抑制炎症因子TNF-α水平，抑制中性粒细胞的聚集与激活，可以调节脑出血模型大鼠脑内炎症环境，减轻炎症反应，对脑组织起保护作用。

BMSCs作为间充质细胞，具有高度自我增殖能力和多向分化潜能，本研究结果证实，BMSCs移植可以影响脑出血大鼠血清中IL-6和TNF-α水平，对TNF-α水平起抑制作用，同时提高IL-6的水平。提示BMSCs移植对免疫调节起一定作用，具体机制还需进一步研究证实。

在造模过程及后续实验过程中无1例死亡。提示移植治疗对脑出血大鼠是安全的，个别大鼠移植后1 w内出现活力减少等现象但后期可恢复正常。但认为BMSCs移植在脑出血治疗上具有很大的潜力和可行性，有望成为脑出血治疗的理想方法。

BMSCs具有干细胞的功能，可促进神经元再生，抑制凋亡等。本研究通过异体BMSCs移植治疗大鼠脑出血，证实移植的BMSCs能明显改善脑出血大鼠神经功能缺损，同时证实其可能减轻脑出血大鼠炎症反应，改善损伤处微环境，从而对血肿周围组织起保护作用。本研究并未对BMSCs对神经元[10]细胞的凋亡作用进行研究，并未对神经细胞凋亡作用进行研究，后续研究进一步进行。