巩晓芸， 赵 静， 胡 泊， 王 鹏， 朱玥洁， 王致辉， 腊晓琳

(新疆医科大学第一附属医院生殖医学中心， 乌鲁木齐 830054)

体外受精—胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET)过程中配子冷冻、卵裂期胚胎冷冻和囊胚期胚胎冷冻是目前符合伦理规范临床广泛应用的人类生育能力保存措施，对不可逆生育能力损伤的保存，避免IVF剩余胚胎的浪费，提高累积妊娠率等方面有重要意义，其中卵裂期胚胎的冷冻复苏占据主要地位[1]。玻璃化冷冻复苏技术是主要的冷冻方法，它使细胞在高浓度冷冻保护剂作用下呈现无序排列的“玻璃态”，避免冰晶损伤造成的细胞死亡[2]。但是在临床应用中除了备受关注的前瞻性安全问题外，高浓度的玻璃化冷冻液对胚胎发育的潜在毒性,操作过程的细节和冷冻载体的改良也是人胚胎冷冻领域的研究热点[2-3]。本研究对新疆医科大学第一附属医院生殖医学中心2016年间采用叶片(Cryoleaf)载体和闭合型拉细麦管(closed pulled straw，CPS)载体共860个周期的冷冻复苏资料进行对比, 探讨冷冻载体对卵裂期胚胎冷冻复苏结局的影响，旨在为进一步提高人类卵裂期胚胎冷冻复苏效果提供依据。

1 材料与方法

1.1研究对象2016年1-12月在新疆医科大学第一附属医院生殖医学中心行冻融胚胎移植(FET)的患者。纳入标准：(1)移植2枚常规体外受精(in vitro fertilization，IVF)胚胎；(2)至少一枚移植胚胎级别优于等于2级且胚胎细胞数目≥6细胞；(3)内生殖器官无器质性病变。排除标准：(1)近期内分泌功能障碍且服用激素类药物；(2)子宫内膜异位症和子宫腺肌症；(3)全身性疾病。纳入符合条件者860个周期，其中叶片(Cryoleaf)载体组522个周期，闭合型拉细麦管(closed pulled straw，CPS)载体组338个周期。

1.2方法

1.2.1 促排卵方案 所有纳入研究的患者均在生殖医学中心使用经典长方案、拮抗剂方案或黄体期促排方案进行控制性超促排卵，当至少有2枚卵泡直径>18 mm时，给予注射人绒毛膜促性腺激素(human chronic gonadotropin，hCG)10 000 IU或艾泽250 μg，34～36 h后行阴道超声引导下取卵术。

1.2.2 解冻周期内膜准备 (1)自然周期：于月经第9天或第10天行阴道超声监测，当内膜厚度>7 mm以上，于排卵日至移植日分别给予黄体酮肌注20、40、60 mg。排卵后3 d行解冻胚胎移植；(2)激素替代周期：于月经第3天给予口服补佳乐或芬吗通6～8 mg/d，月经第9天行阴道超声监测，当内膜厚度>7 mm后给予黄体酮肌注20、40、60 mg直至移植日，3 d后行解冻胚胎移植。

1.2.3 胚胎培养 胚胎培养卵裂期胚胎培养基(Continuous Single Culture，CSC)添加10%血清替代品(serum substitute supplement,SSS)制成胚胎培养液，在3001型号培养皿中做成多个20 μL微滴，后覆盖胚胎培养用矿物油3 mL，放置37℃,5% CO2培养箱中(美国Irvine Scientific公司产品)。

1.2.4 胚胎冷冻复苏 冷冻胚胎选择常规体外受精方式进行受精，取卵后第3天依据诊疗常规中胚胎形态学评估标准进行胚胎评分，选择至少一枚优于等于2级且胚胎细胞数目≥6细胞胚胎进行冷冻。

冷冻载体：叶片(Cryoleaf)载体(见图1，美国Irvine Scientific公司产品)。闭合型拉细麦管(closed pulled straw，CPS)载体(见图2，美国Irvine Scientific公司产品)。

图1 叶片载体

图2 闭合型拉细麦管

胚胎冷冻：室温(24±2)℃操作环境，冷冻：将胚胎移至平衡液(Equilibration Solution， ES)[(4-(2- Hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid，HEPES)+7.5%乙二醇(ethyleneglycol,EG)+7.5%二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)+20%SSS)]中，静置(5～15 min)至细胞完全膨胀后，转移至玻璃化液(Vitrification Solution，VS)(HEPS+ 15%EG+15%DMSO+20% SSS+0.5 mol/L蔗糖)中静置60 s：(1) Cryoleaf载体：30 s内将胚胎转移至叶片载体前端迅速投入液氮，插入管套。(2)CPS载体：30 s内将含有胚胎的玻璃化液抽吸至CPS管中，迅速封口投入液氮。

胚胎解冻：将胚胎从液氮中取出迅速置于37℃TS解冻液(Thawing Solution，TS)(HEPES+1 mol/L蔗糖+20%SSS)中静置1 min ，转移至室温(24±2℃)DS解冻液(Dilution Solution，DS)(HEPES+0.5 mol/L蔗糖+20%SSS)中静置4 min，转移至室温(24±2℃)WS解冻液(Washing Solution，WS)(HEPES +20%SSS)中静置8 min，转入胚胎培养皿中，放置于37℃、6%CO2培养箱内培养。

1.2.5 解冻胚胎移植后黄体支持 黄体酮针剂60 mg肌注，或雪诺酮黄体酮阴道缓释凝胶(默克雪兰诺，瑞士)90 mg阴道给药，每日1次连用14 d。14 d后根据血hCG值和B超检查结果调整用药。

1.3观察指标包括胚胎复苏率、胚胎完全复苏率、胚胎种植率、临床妊娠率。复苏胚胎标准：≥50%卵裂球存活。卵裂球存活标准为：胞膜完整且胞质折光性好，透明带完整。临床妊娠标准：胚胎移植后4～5 w超声检查，见妊娠囊。胚胎复苏率(%)=复苏胚胎个数/解冻后胚胎个数×100%；胚胎完全复苏率(%)=完全复苏胚胎个数/解冻后胚胎个数×100%；临床妊娠率=临床妊娠周期数/移植周期数×100%；胚胎种植率=妊娠囊个数/移植胚胎个数×100%。

2 结果

2.12组患者基本情况比较Cryoleaf载体组和CPS载体组年龄、不孕年限、体质指数(BMI)、移植日内膜厚度，移植胚胎个数及移植优质胚胎个数差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 2组患者基本情况比较

2.22组冷冻复苏结局比较Cryoleaf载体组和CPS载体组间胚胎复苏率和胚胎种植率差异无统计学意义(P>0.05)；Cryoleaf载体组胚胎完全复苏率和临床妊娠率均高于CPS载体组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 2组冷冻复苏结局比较

3 讨论

3.1冷冻载体对人卵裂期胚胎复苏的影响胚胎冷冻时细胞内冰晶的形成是造成胚胎死亡的主要原因，冷冻保护剂的渗透和交换能避免细胞内冰晶的形成，减少冷冻物理损伤，但是常温状态冷冻保护剂自身的毒性又会对细胞造成化学损伤[2]。权衡冰晶形成和冷冻保护剂的毒性是胚胎复苏的关键。玻璃化冷冻复苏法的优势在于使用高浓度冷冻保护剂让细胞快速降温通过冰点温度，形成玻璃态避免冰晶形成，但是在动物实验中证实冷冻保护剂浓度越高对胚胎复苏及发育潜能影响越差。研究发现多种冷冻保护剂组合使用能相互制约其单一的毒性影响，而且分步使用相对于一步法更为安全[4-6]。而通过冷冻载体提高玻璃化冷冻过程中的降温速率，使胚胎迅速通过冰晶形成临界温度区，同时减少冷冻保护剂的接触剂量，是本研究关注的重点。Cryoleaf载体和CPS载体是目前临床广泛使用的玻璃化冷冻载体，其设计理念是减少承载冷冻保护剂体积，提高达到玻璃化状态的速率。

本研究结果表明Cryoleaf载体组的胚胎完全复苏率高于CPS载体组，可能与胚胎降温速度和冷冻保护剂接触剂量有关。一方面使用Cryoleaf载体时，液氮与含胚胎冷冻液直接接触，相对于CPS载体与液氮间隔冷冻管壁而言，降温速度增快；另一方面Cryoleaf载体承载约1 μL冷冻保护剂而CPS载体承载约2 μL冷冻保护剂，小剂量的冷冻保护剂更易热传导使胚胎快速达到玻璃化状态提高冷冻速率。但是Cryoleaf载体组胚胎复苏率和CPS载体组差别无统计学意义，提示冷冻保护剂的毒性作用对胚胎单个细胞冷冻复苏完整性有影响。

3.2冷冻载体对人卵裂期胚胎复苏后发育潜能的影响胚胎的发育潜能是指胚胎复苏后持续生长的能力和着床的能力，更能反映冷冻过程对胚胎发育的延伸影响。冷冻解冻过程造成的直观可见损伤是细胞溶解，不可见损伤是改变胚胎的代谢和相关酶的活性[7-8]，后续造成胚胎发育和着床障碍。研究表明[9]，快速完全的玻璃化态是确保玻璃化冷冻复苏效果的关键因素，对某个特定的冷冻保护剂，随着玻璃化能力的增大其生物化学毒性也随之增加，因此在确保完全玻璃化的前提下快速最小剂量接触冷冻保护剂成为解决这一矛盾的研究方向。从设计上Cryoleaf载体冷冻保护剂承载剂量和接触时间(40 s)远小于CPS载体(60 s～90 s)，使胚胎在相同浓度冷冻保护剂的环境中，以最小剂量快速降温和复温，有利于避免“去玻璃化”的二次损害[6]。本研究结果显示,Cryoleaf载体组临床妊娠率高于CPS载体组(P<0.05)，而2组间胚胎种植率并未显示出相对CPS载体组的优势(P>0.05)，提示玻璃化冷冻过程对胚胎的潜在毒性随降温速率增加而减少，在一定程度上去除不可逆损伤细胞，是实现自然淘汰的有效途径[10]。而Cryoleaf载体直接接触未过滤液氮的潜在毒性是否影响胚胎发育潜能，尚需进一步观察。但是Cryoleaf载体玻璃化冷冻操作的高效率相对于CPS载体，仍具有一定的优越性。

在安全性的前提下，通过改良冷冻载体完善细节操作和提高液氮清洁度等环节，进而改善人卵裂期胚胎玻璃化冷冻复苏结局，需要进一步临床研究。