秦智伟，于思琦，刘　东，辛　明，周秀艳

（1.农业部东北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室，哈尔滨　150030；2.东北农业大学园艺园林学院，哈尔滨　150030）

黄瓜（Cucumis sativus L.），别名胡瓜、王瓜，为葫芦科甜瓜属一年生攀缘草本植物，起源于喜马拉雅山脉热带地区[1]。黄瓜生产栽培常受各种病原菌侵染，影响产量和品质。近年来，随着世界保护地蔬菜栽培面积扩大，为多种流行病害提供适宜生存环境，寻找抗病基因对黄瓜抗病性育种意义重大。

GASA基因家族是一类受GA调控的基因家族[2]。GASA蛋白结构包含N-端信号肽序列，该序列通常由18～29个氨基酸残基组成；信号肽后面是由7～31个极性氨基酸残基组成的亲水区域；C-端是约60个氨基酸组成的高度保守结构域，即GASA结构域[3]。GASA结构域是GASA家族成员核心结构域，Rubinovich和Sun等研究认为，该结构域缺失或保守半胱氨酸残基突变均会导致GASA蛋白丧失功能[4-5]。张强等研究表明，GASA蛋白多数属于分泌蛋白一类，该家族蛋白结构相似，但功能各异[6]。Kotilainen等研究表明，同为GASA基因家族不同成员功能可能相同或相反，非洲菊GEG和PRGL基因在花瓣伸长中表现相反功能——GEG基因通过抑制细胞伸长而抑制花瓣尺寸[7]，PRGL基因则相反[8-9]。Shi等在赤霉素缺失的番茄突变体gib1中分离出的GAST1基因是首个GASA基因家族成员[10]。Herzog等在拟南芥中发现GASA基因家族[11]。矮牵牛[12]、非洲菊[7]、马铃薯[13]、水稻[14]、草莓[15]等中也有该家族基因。GASA蛋白在植物生长发育阶段[16-18]、非生物胁迫[12,19]、生物胁迫[13,20]及激素信号转导[5,21]中均有显著作用。多数GASA家族基因受GA调控。赤霉酸（GA3）诱导矮牵牛后得到4个GIP同源基因高表达[12]；Furukawa等利用GA3促进水稻和GA合成缺失突变体中OsGASR1和OsGASR2表达[14]。GASA家族基因在非生物、生物胁迫中作用也有研究，拟南芥GASA4基因超量表达后可提高转基因植株耐热性[22]；Snakin-2基因在机械损伤后显著上调表达，Snakin-2超量表达后显著提高病原体抵抗能力[13]。目前该家族基因在黄瓜育种中研究较少。

本研究选取霜霉病与棒孢叶斑病两种病害胁迫下，在黄瓜抗病品种上调表达、感病品种下调表达的基因，作克隆及生物信息学分析，以期探明其基因序列结构、进化关系及理化性质，为进一步探究该基因功能及抗病机制奠定基础。

1　材料与方法

1.1　材料

试验材料选取抗霜霉病和棒孢叶斑病双抗品种D9320及双感病品种D0401[23]。种子经催芽处理12 h后，于2017年7月置于恒温培养箱中白天温度25～28℃，夜间温度18～20℃，培养至两叶一心。黄瓜种子由东北农业大学园艺园林学院黄瓜课题组提供。提取RNA的Trizol试剂购自Invitrogen公司，反转录试剂盒、胶回收试剂盒、Taq酶、大肠杆菌感受态细胞Trans1-T1均购自北京全式金生物技术有限公司，T3克隆载体购自TaKaRa生物工程有限公司。

1.2　方法

1.2.1黄瓜总RNA提取与cDNA链合成

剪取约100 mg黄瓜新鲜叶片，加入液氮后充分研磨，采用Trizol法提取黄瓜总RNA。提取后通过凝胶电泳检测RNA纯度是否可用于后续试验。利用反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA，保存于-20℃冰箱待用。

1.2.2基因编码区序列获得

利用黄瓜基因组数据库（http://www.icugi.org/），输入基因登录号CSa3G826660，下载该基因编码区序列。

1.2.3基因引物设计与合成

使用Primer Premier 5.0软件作克隆基因编码区全长引物设计，上下游引物序列：CsGASA4-F，5'ATGGCGATGCCCAAGTTCGCTG 3'； CsGASA4-R，5'TTAAGGGCATTTGGGTCCTCCTTCC 3'。引物序列由哈尔滨博仕科技有限公司合成。

1.2.4基因克隆

利用RT-PCR扩增目的片段，PCR反应体系（20 μL）为：cDNA模板2.5 μL；SuperMix 11.5 μL，H2O44 μL；上下游引物各 1 μL。PCR 反应程序为：95℃预变性5 min；95℃变性1 min，55.3℃退火1 min，72℃延伸30 s，32个循环；72℃延伸10 min；4℃保存。扩增结束后将PCR扩增产物作琼脂糖凝胶电泳检测条带正确后，使用北京全式金胶回收试剂盒回收目的条带。将回收片段连接T3载体，连接体系为：目的基因4 μL，T3连接酶1 μL，室温（20～37℃）反应5 min，反应结束后采用热激法转化大肠杆菌感受态细胞Tans1-T1，在含有X-Gal、IPTG、Amp的LB琼脂平板上37℃过夜培养，筛选白色单菌落单独培养，菌液PCR后，凝胶电泳检测条带正确，送苏州金唯智生物科技有限公司测序。

1.2.5编码蛋白生物信息学分析

本研究主要利用生物信息学分析网站（如表1所示）预测编码蛋白理化性质、亲疏水性、亚细胞定位、跨膜区域、信号肽及蛋白质二三级结构，为该基因功能解析提供依据。

2　结果与分析

2.1　黄瓜总RNA提取及检测

采用Trizol法提取黄瓜叶片总RNA，凝胶电泳结果表明，RNA提取效果良好，基本无蛋白污染。凝胶电泳检测条带如图1所示，28S、18S、5S 3条带较清晰，且宽度比较适宜，黄瓜RNA提取效果可用于后续试验研究。

2.2　基因克隆

PCR程序扩增得到目的产物凝胶电泳检测结果见图2。该片段长度为315 bp。经苏州金唯智生物技术有限公司测序，结果与黄瓜基因组数据库该基因CDS全长序列通过NCBI中Blast对比后，相似度100%，测序结果与目的基因完全一致，无碱基发生突变，该基因已连接T3载体，表明克隆成功。

表1　生物信息学分析网站及功能预测Table 1　Website of bioinformatics analysis and function rediction

图1　黄瓜总RNA提取Fig.1　Extract of cucumber RNA

图2　CsGASA4基因PCR扩增产物Fig.2　PCR amplification production of CsGASA4

2.3　生物信息学分析

登陆黄瓜基因组数据库（http://www.icugi.org/）分析该基因结构，显示CsGASA4基因编码区有4个外显子，3个内含子，编码区全长315 bp，起始密码子ATG，终止密码子TAA。通过Primer Premier 5.0将核苷酸序列翻译成氨基酸序列，对编码蛋白进一步作生物信息学分析。

2.3.1蛋白质理化性质分析

利用NCBI的Blast对比显示该蛋白含有GASA super-family结构域，第45个氨基酸到第104个氨基酸为GASA功能结构域，属于GASA家族蛋白，并将编码该蛋白基因命名为CsGASA4（见图3）。登陆 ProtParam（https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam）分析氨基酸理化性质，结果显示CsGASA4蛋白由104个氨基酸组成，预测相对分子质量11 458.74，理论等电点9.64，分子式C500H795N147O128S17，原子总数1 587，不稳定系数34.12（不稳定系数＜40时稳定），属于稳定蛋白，脂肪系数54.52。

利用 Protscale（https://web.expasy.org/protscale/）预测基因编码蛋白亲疏水性，结果显示，第13个氨基酸位置有最高疏水值3.511，第32个氨基酸位置有最大亲水值-2.689，平均亲水系数-0.183，为亲水蛋白（见图4）。

2.3.3CsGASA4蛋白亚细胞定位预测

基因通过编码蛋白行使功能，蛋白需处于细胞中特定亚细胞位置而发挥功能，蛋白质位置与其功能密切相关，同样蛋白亚细胞定位在一定程度上反映其对应基因功能[24]。本研究利用蛋白质亚细胞定位在线工具WoLF PSORT Prediction（https://www.genscript.com/psort.html）预测该蛋白位于分泌系统囊泡中（见表2）。

图3　CsGASA4蛋白保守结构域Fig.3　Conserved domain of CsGASA4 protein

图4　CsGASA4蛋白亲疏水性预测Fig.4　Prediction of hydrophilicity and hydrophobicity of CsGASA4 protein

表2　PSORT预测CsGASA4蛋白亚细胞定位Table 2　Subcellular location of CsGASA4 protein based on PSORT

2.3.4CsGASA4蛋白跨膜区域预测

利用TMHMM Sever v.2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）输入CsGASA4蛋白序列在线预测蛋白质跨膜螺旋，结果显示该基因编码蛋白在前30个氨基酸位置有一个明显跨膜区域，因此预测CsGASA4蛋白属于跨膜蛋白（见图5）。

2.3.5蛋白质信号肽预测

利用常用在线工具SignalP 4.1 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）预测黄瓜蛋白信号肽。通常情况，信号肽在蛋白质N端，极少超过45个氨基酸残基。本研究对该基因编码共104个氨基酸均分析信号肽。C值最大，S值陡峭，Y值最高峰位置预测为信号肽剪切位点。分析结果表明，第26和27个氨基酸之间位置有一个信号肽剪切位点，因此预测CsGASA4蛋白属于分泌蛋白（见图6）。

2.3.6基因编码蛋白质结构预测

2.3.6.1蛋白质二级结构预测

使用SPOMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）在线工具预测CsGASA4蛋白二级结构，预测结果显示该蛋白中62个氨基酸形成无规则卷曲占比最多，占比59.62%；36个氨基酸形成α螺旋，占比34.62%；有4条扩展链，占比3.85%；还有2个形成β-折叠，占整条链1.92%（见图7）。

图5　CsGASA4蛋白TMHMM跨膜结构预测Fig.5　Tansmembrance domain of CsGASA4 protein predicted by TMHMM

图6　CsGASA4蛋白SignalP-HMM信号肽预测Fig.6　Signal peptide of CsGASA4 potein predicted by SignalP-HMM

图7　CsGASA4蛋白二级结构预测Fig.7　Prediction of secondary structure of CsGASA4 potein

2.3.6.2蛋白质三级结构预测

登陆SWISS-MODEL（https://www.swissmodel.expasy.org/）网站预测该基因编码蛋白质三级结构，预测结果见图8。

2.3.7系统进化树

登陆 NCBI网站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）下载编码蛋白为GASA家族蛋白其他物种13个基因，同源序列聚类分析，输入MEGA软件以Neighbor-joining法构建系统进化树（见图9）。结果表明，黄瓜CsGASA4基因与大马士革玫瑰FJ595792亲缘关系最近，序列同源性达79%，属1个分支；与矮牵牛（AJ417391、AJ417390、AJ417389）、拟南芥（AT1G74670、AT5G15230）、玉米AY103785亲缘关系较近；与欧亚花魁AF060569亲缘关系最远。

图8　蛋白质三级结构预测Fig.8　Prediction of tertiary structure of CsGASA4 protein

图9　蛋白系统进化树分析Fig.9　Analysis of protein system phylogenetic tree

3　讨论与结论

GASA基因家族是植物特有基因。GASA蛋白是植物特有一类小分子蛋白，多数成员由80～120个氨基酸组成，也有少数成员氨基酸较多，拟南芥AtGASA14蛋白由245个氨基酸组成。GASA蛋白生物学功能主要表现在参与植物防御反应和生长发育、响应植物激素、调控植物激素信号转导过程、参与氧化还原反应等。张盛春等研究表明，拟南芥GASA基因家族包含15个基因，该家族成员均有一个信号肽，长度约20个氨基酸，且信号肽后均有一个剪切位点，预测该家族蛋白属于分泌型胞外蛋白，分析该家族蛋白功能结构域发现，其中14个成员均含有一个保守GASA结构域，其中GASA13蛋白除含一个GASA结构域外还含一个PRP结构域，PRP结构域是细胞壁蛋白重要特征之一[25]。截至目前，拟南芥15个GASA基因家族中，GASA4基因功能阐明较全面。

目前报道水稻GASA家族中有9个同源基因，其 中 OsGSR1、 OsGASR1、 OsGASR2、 OsGASR3、OsGASR4在时空表达模式、激素调节及分子机制等方面均有相关研究。罗曼研究表明外源GA3对Os-GASR1和OsGASR2基因表达无影响，但可促进Os-GASR3基因表达，抑制OsGASR4基因表达。OsGSR1、 OsGASR1、 OsGASR2、 OsGASR3、 Os-GASR4基因在水稻生长发育过程中有不同功能。OsGASR1在多数幼嫩组织及代谢旺盛部位表达；OsG4SR3在营养生长时期仅在幼根中表达，在生殖生长时期则主要在颖花中表达；OsG4SR4在营养生长时期仅在幼茎节中表达，在生殖生长时期主要在花序中表达[26]。GASA蛋白多数定位于细胞壁和质外体中，Furukawa等研究表明，水稻OsGASR1、OsGASR2位于细胞壁[14]，Zhang等试验表明，拟南芥GASA5定位于细胞壁或细胞外基质[19]。本研究中预测黄瓜CsGASA4基因亚细胞定位于分泌系统囊泡中，尚待后续试验验证。

GASA基因家族编码蛋白主要有3个特征：靠近C-端有GASA家族结构域、亲水区结构、N-端信号肽[27]。本研究分析结果表明CsGASA4基因具有该家族典型特征。有关GASA家族基因研究中，通常研究其在生长发育各阶段功能，外部激素诱导后植株响应，但有关病害胁迫中该家族基因功能研究较少。本文筛选经霜霉病和棒孢叶斑病两种病原菌胁迫后，在抗病品种中上调表达、感病品种中下调表达基因之一，编号为Csa3G826660，该基因属于GASA蛋白家族，命名为CsGASA4。本研究成功克隆获得黄瓜CsGASA4基因，明确其保守结构域、编码蛋白、亚细胞定位等生物信息，为后续研究黄瓜CsGASA4基因对两种病害胁迫响应、功能分析及抗病机制研究奠定基础。