陈青奇，张　红，姜景彬，李景富

（东北农业大学园艺园林学院，哈尔滨　150030）

植物受外界刺激，体内形成信号传递过程，诱导植物相关防御基因表达，抵御不良环境影响，转录因子在此过程中具有重要作用。近年来，转录因子防护反应和逆境胁迫应答反应方面研究日益深入。Yang等研究发现，部分转录因子与植物抗逆性相关，转录因子可激活或促进下游基因表达，使植物获得抗性[1]。

随功能基因组学研究不断深入，基因芯片等高通量技术鉴定基因表达特性方法广泛应用于植物非生物胁迫基因表达研究，鉴定多种与非生物胁迫相关转录因子[2-3]。WRKY基因家族是植物最大转录因子家族之一[4-6]，广泛参与生物、非生物胁迫应答反应，并在信号分子传递及植物衰老和体细胞胚发育方面发挥重要作用[7]。WRKY转录因子含有一段大约由60个高度保守氨基酸残基组成的多肽序列，被称为WRKY结构域，其N-末端含有7个标志性氨基酸残基WRKYGQK[8-9]。另外，WRKY转录因子DNA结合域一般均含一个锌指结构。根据转录因子所含WRKY结构域数量和锌指结构特征，一般将WRKY转录因子分为3大类[10]：第Ⅰ类含2个WRKY结构域，且锌指结构类型属C2H2型；第Ⅱ类仅含1个WRKY结构域，锌指结构为C2H2型，大部分WRKY转录因子均属该类型；第Ⅲ类仅含1个WRKY结构域，锌指结构为C2-HC型。首先在甜薯中发现第一个WRKY转录因子，目前证实多种植物均参与非生物胁迫反应，部分WRKY基因参与多种胁迫应答[11-13]。番茄中发现有81个WRKY基因家族成员[14]。

非生物胁迫下主要通过表达谱分析WRKY转录因子，Seki等研究发现，拟南芥在干旱、寒冷、高盐条件下，40个转录因子表达上调，其中4个是WRKY转录因子，分别是At1g80840、At2g30250、At5g13080和At4g18170[15]。Ramamoorthy等利用qRT-PCR方法分析水稻WRKY基因家族在低温、干旱、盐及激素处理条件下变化发现，发现16个WRKY基因响应低温胁迫，但其中仅有1个基因表达上调；19个WRKY基因响应干旱胁迫，基因全部表达上调；27个WRKY基因响应盐胁迫，其中26个基因表达上调[16]。仇玉萍等利用Northern杂交方法分析13个水稻WRKY基因在非生物胁迫（高盐、4℃低温和42℃高温）下应答反应，其中9个WRKY基因表达均受到3种胁迫影响，而OsWRKY9、Os-WRKY21、OsWRKY24和OsWRKY30这4个WRKY基因不受诱导[17]。

本研究通过番茄WRKY基因家族生物信息学分析，选取6个WRKY基因SlWRKY13、SlWRKY24，SlWRKY31、 SlWRKY50、 SlWRKY62、 SlWRKY63，分析低温、干旱、盐胁迫处理条件下叶片表达量差异，通过比较不同处理不同时间基因表达量变化，分析基因在逆境环境下应答情况。对逆境胁迫应答分析中表达量变化较显著基因作基因沉默分析，基因沉默后，检测低温胁迫条件下MDA、Pro和SOD指标变化，为进一步研究WRKY基因家族功能提供参考及理论依据。

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1植物材料

醋栗番茄（LA2184）由东北农业大学园艺园林学院番茄研究所提供。

1.1.2主要试剂

主要试剂：TRIZOL、EasyTaq酶、cDNA第一链合成试剂盒、质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒购自全式金公司，Maker DNA Marker购自天根生物科技有限公司，其他化学试剂为国产分析纯，AceQ qPCR（SYBR Green Master Mix）购自Vazume，氨卞青霉素（Ampicillin，Amp）、卡拉霉素（Kanamycin，Kan）、利福平（Rifampin，Rif）均购自 TaKaRa公司。主要载体及菌株：限制性内切酶XbaⅠ、Bam HⅠ和T4DNA连接酶购自Fermantas公司，pTRV1、pTRV2、大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α、农杆菌（Agrobactterium tumefaciens）LBA4404为东北农业大学番茄研究所保存。

1.2　方法

1.2.1番茄WRKY基因非生物胁迫条件下表达模式分析

1.2.1.1不同逆境条件下材料处理及制备

醋栗番茄（LA2184）于2016年2月10日种植于东北农业大学园艺实验站温室，取4叶期幼苗用于逆境胁迫试验处理。低温胁迫试验中，选取生长状态和植株大小一致4叶期幼苗6棵，置于5℃人工气候箱中（Conviron，Canada），每隔0、1、3、6、12、24 h取叶片；高盐胁迫试验中，选取生长状态和植株大小一致4叶期醋栗番茄幼苗6棵，置于 0.2 mmol·L-1NaCl溶液中，每隔 0、1、3、6、12、24 h取叶片；干旱胁迫试验中，选取生长状态和植株大小一致4叶期幼苗6棵，置于20%PEG中，每隔0、1、3、6、12、24 h取叶片。取完叶片后立即置于-80℃超低温冰箱保存备用。试验重复3次。

1.2.1.2RNA提取

采用Trizol法提取RNA。

1.2.1.3反转录和gDNA去除

根据RNA浓度调整反转录用量，保证反转录后浓度一致。使用全式金公司反转录试剂盒，根据全式金公司反转录试剂盒说明操作：

（1）在去除RNAse离心管中配制以下反转录混合液，冰上操作。Total RNA 100 ng～5 μg：Anchored Oligo（dT）18Primer（0.5 μg·μL-1）1 μL，2×TS Reaction Mix 10 μL，TransScript RT/RI Enzyme Mix 1 μL，gDNA Remover 1 μL，RNase-free Water to 20 μL。

（2）混匀离心，产物用于qPCR，42℃孵育反转录15 min，产物用于PCR，42℃孵育反转录30 min，85℃加热5 s失活TransScript RT/RI Enzyme Mix和gDNA Remover。

1.2.1.4qRT-PCR检测胁迫条件下WRKY基因表达

本试验选取6个WRKY基因（SlWRKY13、Sl-WRKY-24、SlWRKY31、SlWRKY50、SlWRKY62 和SlWRKY63），运用qRT-PCR方法检测醋栗番茄不同时间不同胁迫条件下采集叶片作表达情况，运用SYBR Green I法作荧光定量PCR。以番茄肌动蛋白基因Actin（基因登陆号U60480.1）为内参基因。Actin引物作qRT-PCR检测CT值，使CT值落在20～28。为更准确检测基因表达量变化，每个样品设置3次重复，未添加模板和未反转录RNA为模板的反应作为阴性对照（No template control，NTC）。利用qRT-PCR软件作溶解曲线分析，出现单峰时表示结果可靠。SYBR Green I试剂应避光保存，为保持其活性，在冰上加样操作，尽量缩短操作时间，减小非特异扩增，避免产生气泡，保证加样量准确性，加样后用低速离心机充分混匀。

使用Primer 5.0软件设计荧光定量PCR引物，设计6个SlWRKY基因引物（见表1）。使用iQ5实时PCR检测系统（Bio-Rad，USA）反应。反应程序为95℃ 10 min，40×（95℃5 s，59℃15 s，72℃30 s）。溶解曲线分析采用95℃条件下15 s，55℃15 s，每循环缓慢升温0.5℃至95℃，伴随荧光采集。通过所得CT值计算基因相对表达量，数据分析采用2-△△CT法。

表1　WRKY基因引物Table 1　WRKY genes primer

1.2.2番茄WRKY基因沉默分析

1.2.2.1SlWRKY50-TRV2和PDS-TRV2载体构建基因

①RNA提取同1.2.1.2，反转录同1.2.1.3。

②VIGS引物设计：根据SGN上SlWRKY50（Solyc07g005650.2.1）基因登陆mRNA序列，运用Primer 5.0软件设计PCR引物，加XbaⅠ和Bam HⅠ内切酶酶切位点。

由华大基因公司合成：SlWRKY50-F：5'GCTCTAGATCAGCAGCAGG AGGTGAATA 3'XbaⅠ，Sl-WRKY50-R：5'CGC GGATCCCGGTCCAAATGTTACTAACTTTTCC3'Bam HⅠ。

③PDS和SlWRKY50片段扩增

反应体系：Template（cDNA）2 μL，10×Trans Taq HiFi BufferⅡ 5 μL，dNTPs（2.5 mmol·L-1）4 μL，Primer-F（10 μmol·L-11 μL，Primer-R（10 μmol·L-1）1 μL，10×Trans Taq HiFi DNA Polymerase 1 μL，ddH2O 36 μL，总体积50 μL。

反应程序：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，65℃复性30 s,72℃延伸30 s，扩增35个循环，72℃延伸10 min，置于4℃保存。1%琼脂糖凝胶电泳，80～120 V，20 min；凝胶成像系统观察条带情况。

④片段产物PCR纯化：使用DNA纯化试剂盒纯化目标片段PDS和SlWRKY50。

⑤纯化后目标片段双酶切

酶切反应体系如下：PCR纯化产物16 μL，10×Tango Buffer 2 μL，Bam HⅠ 1 μL，XbaⅠ 1 μL混匀，稍离心，37℃酶切3～4 h，纯化，-80℃存放备用。

⑥TRV2载体制备

将携带pTRV2载体大肠杆菌DH5α在LB（50 μg mL-1Kan）平板培养基上划线，37℃条件下恢复培养，至平板出现1 mm菌落时，挑取单菌落，接种于 5 mL LB（50 μg·mL-1Kan）液体培养基中，37℃，220 r·min-1条件下震荡培养12 h，使用质粒提取试剂盒提取空载体pTRV2，然后pTRV2双酶切及特异片段胶回收。

⑦目的片段与载体连接

将准备好的酶切载体与目的基因片段SlWRKY50用T4连接酶连接。连接体系：Vector 3 μL，insert fragment 10 μL，T4-ligase（5 U·μL-1）1 μL，10×Tango Buffer 2 μL，加ddH2O到20 μL，22 ℃条件连接4 h。

⑧连接产物转化大肠杆菌DH5

取无菌1.5 mL离心管，每管依次加入10 μL质粒DNA，50 μL大肠杆菌感受态细胞悬浮液，枪头反复吸取混匀。冰浴30 min；放入42℃水浴锅90 s；冰浴2 min。加入300 μL LB，置于37℃摇床200 r·min-1温育3～4 h使细菌复苏。4 000 r·min-1离心2 min，收集菌体于管底。吸去300 μL上清，反复吹打以重悬菌体，均匀涂布于加有卡那霉素LB平板，倒置于37℃温箱中培养过夜，至出现1 mm单菌落。4℃冰箱存放。

⑨阳性菌落筛选与鉴定

灭菌枪头挑取单菌落至含3 mL LB液体培养的5 mL灭菌离心管中，37℃，200 r·min-1振荡培养5 h，使用原扩增引物、体系、条件对菌液作PCR鉴定，扩增产物1%琼脂糖凝胶电泳检测。检测含目的条带菌液，重新摇菌后，提取质粒双酶切验证，成功后送华大基因测序，测序结果与基因序列一致即代表载体构建成功。

⑩农杆菌感受态细胞转化

将转化质粒2 μg加入农杆菌感受态细胞，轻轻混匀，冰上放置5 min。将离心管用封口膜密封后，放液氮罐中迅速冷冻1 min，移至37℃水浴热激5 min（防止管崩），向离心管中加入800 μL LB液体培养基，于温度28℃，220 r·min-1恒温振荡摇床培养4 h使细菌复苏。4 000 r·min-1离心2 min，吸去400 μL上清，轻弹重悬沉淀，将剩余菌液均匀涂布于LB固体培养基（含50 μg·mL-1Kan和50 μg·mL-1Rif）上，倒置于28 ℃温箱中培养1～2 d至出现单菌落。将鉴定结果正确阳性工程菌扩大培养，并向菌液中加入等体积50%无菌甘油，混匀后保存于-80℃冰箱，用于后续试验。

1.2.2.2番茄植株侵染

以醋栗（LA2184）为材料，采用无菌土播种，待植株长至4片真叶时侵染。保存于-70℃，携带TRV2:PDS载体和TRV1载体两个农杆菌株系恢复培养。在LB（50 μg·mL-1Kan，100 μg·mL-1Rif）平板培养基划线，30℃恢复培养48 h，挑取单菌落，接种于3 mL LB（50 μg·mL-1Kan，100 μg·mL-1Rif）液体培养基中，30℃，200 r·min-1震荡培养16～18 h。侵染具体方法参照文献[18]。

1.2.2.3基因沉默植株沉默效果检测

植株沉默后，观察植株表型变化。提取接种农杆菌植株RNA并反转录cDNA，利用cDNA为模板，通过荧光定量PCR检测植株沉默情况。具体方法同1.2.1。

1.2.3沉默植物相关生理指标测定

1.2.3.1基因沉默植株逆境胁迫处理及样品采集

①高盐胁迫：选取鉴定为阳性沉默植株，以生长状态一致正常植株为对照，0.2 mmol·L-1NaCl处理1 h，分别采集未处理及处理后阳性植株和对照植株叶片保存。

②干旱胁迫：选取鉴定为阳性沉默植株，以生长状态一致正常植株为对照，20%PEG处理1 h，分别采集未处理及处理阳性植株和对照植株叶片保存。

③低温胁迫：选取鉴定为阳性沉默植株，以生长状态一致正常植株为对照，置于5℃恒温培养箱处理1 h，分别采集未处理及处理后阳性植株和对照植株叶片保存。

1.2.3.2相关生理指标测定

丙二醛（MDA）、脯氨酸（Proline）含量、超氧化歧化酶（SOD）活性测定参照文献[19]。

2　结果与分析

2.1　番茄WRKY基因非生物胁迫条件下表达模式分析

2.1.1盐胁迫处理分析

由图1可知，盐胁迫处理前后对照发现，6个WRKY基因对NaCl胁迫均表现显著差异。其中Sl-WRKY13、SlWRKY31、SlWRKY50、SlWRKY62、Sl-WRKY63基因表达水平上调，但随时间延长，基因表达显著下调，说明长时间使用高盐处理，可能抑制该基因表达。且SlWRKY31、SlWRKY50、Sl-WRKY62、SlWRKY63均在NaCl处理1 h后达峰值，SlWRKY13在6 h达峰值，与对照相比差异显著，而SlWRKY24基因表达下调，且与对照相比差异极显著。SlWRKY63与其他5个基因相比，受NaCl处理后表达量变化最大，处理1 h后为对照15倍，其他5个基因峰值时表达量不足对照4倍。

图1　qRT-PCR方法分析6个番茄SlWRKY基因NaCl处理表达情况Fig.1　qRT-PCR analysis of six SlWRKY genes in NaCl treatment of tomato plant

2.1.2干旱胁迫处理分析

由图2可知，干旱胁迫处理前后对照发现，6个WRKY基因对干旱胁迫均表现显著差异。其中SlWRKY13、SlWRKY31、SlWRKY62、SlWRKY63 基因表达上调，SlWRKY24、SlWRKY50基因表达下调。SlWRKY13干旱处理1 h时未见明显变化，处理3 h后显著上调，12 h达最大值，是对照60倍。SlWRKY31、SlWRKY62、SlWRKY63处理3 h时达峰值，且与对照相比差异极显著，SlWRKY63表达量变化范围最大，可达对照500倍，SlWRKY50处理1 h时，表达量下降，直到6 h时上升，几乎达对照表达水平，随后下降。PEG处理24 h时，6个基因几乎均不表达。

2.1.3低温胁迫处理分析

由图3可知，低温胁迫处理前后，6个SlWRKY基因对低温胁迫应答均表现显著变化。其中SlWRKY24基因在植株受到冷胁迫后与对照比表达下调，而SlWRKY13、 SlWRKY31、 SlWRKY50、 SlWRKY62、SlWRKY63基因总体表达上调，SlWRKY13、SlWRKY 62、SlWRKY63处理6 h时达峰值。SlWRKY31、Sl-WRKY50处理1 h达峰值，SlWRKY31与对照相比差异显著，而SlWRKY50与对照相比差异极显著。

图2　qRT-PCR方法分析6个番茄SlWRKY基因PEG处理表达情况Fig.2　qRT-PCR analysis of six SlWRKY genes in PEG treatment of tomato plant

图3　qRT-PCR方法分析6个番茄SlWRKY基因5℃处理表达情况Fig.3　qRT-PCR analysis of six SlWRKY genes in 5℃treatment of tomato plant.

2.2 番茄S1WRKY50基因TRV2载体构建

根据逆境条件下6个WRKY基因表达情况，选取SlWRKY50基因作基因沉默分析，该基因对高温表现下调，对低温表现明显上调，对盐胁迫上调表现不明显，表达特点明确，具有代表性，便于基因沉默分析。

2.2.1目标片段SlWRKY50和PDS扩增

SlWRKY50扩增片段长度313 bp，PDS扩增长度223 bp，该结果与预期PCR结果一致（见图4）。所获SlWRKY50和PDS目标片段可作后续试验。

图4　SLWRKY50和PDS基因扩增Fig.4　Amplification of SLWRKY50 and PDS genes

2.2.2质粒提取

使用质粒提取试剂盒提取空载体pTRV2，获得pTRV2。获得pTRV2提取3个样品均有一条明亮条带，无拖尾现象，证明质粒提取完好（见图5）。可用于后续试验。

图5　提取获得pTRV2载体Fig.5　Extraction of pTRV2 vector

2.2.3重组菌液PCR验证

1%琼脂糖凝胶电泳检验，SlWRKY50片段长度250～500 bp，PDS片段长度100～250 bp，与预期片段一致（见图6）。

2.2.4重组质粒酶切鉴定

经菌落PCR初步鉴定后，提取重组质粒经XbaⅠ和Bam HⅠ双酶切，得到双酶切产物，1%琼脂糖凝胶电泳检测，泳道1～4片段长度为300 bp单一条带，泳道5片段长度100～250 bp，两条片段分别与预期片段一致（见图7）。说明目标片段已连入载体。把重组载体命名为pTRV-SlWRKY50和pTRV-PDS。对重组菌液PCR验证，双酶切成功菌液即阳性克隆送华大基因测序。

2.2.5重组质粒测序结果

将构建成功pTRV2-SlWRKY50和pTRV-PDS送华大基因公司测序，测序结果与SGN公布序列比对一致并未产生突变。

图6　重组质粒菌落PCR验证Fig.6　Verification of recombinant plasmid PCR

图7　重组质粒pTRV-SlWRKY50和pTRV-PDS酶切鉴定Fig.7　Identification of recombinant plasmid TRVSlWRKY50 and pTRV-PDS digested

2.2.6农杆菌侵染

2.2.6.1VIGS沉默效果

番茄幼苗接种农杆菌15 d后逐渐出现白化现象，接种3～4周后番茄幼苗叶片明显漂白（见图8），表明番茄幼苗PDS基因被成功沉默。

2.2.6.2基因SlWRKY50表达量分析

提取接种农杆菌植株RNA并反转录cDNA，利用cDNA为模板，通过荧光定量PCR检测植株沉默情况（见图9）。SlWRKY50在沉默番茄中表达量均下降，说明TRV重组载体已成功转入番茄幼苗并在植株体内复制、表达。

2.3　逆境条件下SlWRKY50基因沉默植株生理指标测定

2.3.1盐胁迫下SlWRKY50基因沉默植株生理指标测定

处理前对照组植株（CK）和沉默植株MDA、Pro和SOD含量均无显著差异。NaCl处理1 h后CK和沉默植株叶片MDA、Pro和SOD含量均升高，但CK植株和沉默植株中检测值差别不明显，沉默植株MDA略上升，Pro和SOD略下降（见图10）。

图8　对照基因PDS沉默导致番茄植株白化现象Fig.8　Silencing of PDS control gene causes photobleaching in tomato plants

图9　SlWRKY50基因在沉默植株叶片中表达水平Fig.9　Expression level of SlWRKY50 genes in the VIGS plants

图10　盐胁迫下沉默植株丙二醛、脯氨酸和超氧化物歧化酶含量Fig.10　MDA,proline and SOD content in the VIGS plants under salt treatment

2.3.2干旱胁迫下SlWRKY50基因沉默植株生理指标测定

处理前对照组植株（CK）和沉默植株MDA、Pro和SOD含量均无显著差异（P＞0.05）。干旱处理1 h后CK和沉默植株叶片MDA、Pro和SOD含量均升高，但CK植株和沉默植株中检测值差别较小。沉默植株MDA略升，Pro和SOD略降（见图11）。

2.3.3低温胁迫下SlWRKY50基因沉默植株生理指标测定

处理前对照组植株（CK）和沉默植株MDA、Pro和SOD含量差异不显著，MDA含量沉默植株稍高于对照。低温处理1 h后，沉默植株MDA含量显著高于CK，沉默植株Pro和SOD含量显著低于CK植株（见图12）。结果表明，SlWRKY50基因沉默后，低温逆境胁迫耐受能力下降。

图11　干旱胁迫下沉默植株丙二醛、脯氨酸和超氧化物歧化酶含量Fig.11　MDA,proline and SOD content in the VIGS plants under drought treatment

3　讨论与结论

植物生长过程中，温度、光照、水分、土壤是生长要素，植物为更好适应外界环境变化，进化系列防御体系调控相关基因和代谢途径，应对各种非生物胁迫影响[20-21]。植物和藻类中，WRKY转录因子家族是经典DNA合成蛋白，WRKY转录因子在植物生物胁迫和非生物胁迫中有重要作用。番茄WRKY基因有不同时间和空间表达模式，响应不同生物和非生物胁迫与不同发育过程[22]，WRKY基因抗病原菌相关研究较多[23-24]，作用于植物生长和次生代谢中[25]。Munns等研究认为WRKY基因家族中，WRKYIIa和IIb亚族与植物非生物胁迫关系较大，如在拟南芥中II-a亚家族WRKY基因参与非生物胁迫响应，AtWRKY18、AtWRKY40和At-WRKY60在植物响应ABA和非生物胁迫时呈复杂表达模式[26]，因此本试验从已报道81个WRKY基因家族中，通过前期研究选取6个典型WRKYIIa和IIb亚族基因SlWRKY13、SlWRKY-24、Sl-WRKY31、SlWRKY50、SlWRKY62、SlWRKY63，通过低盐、高温、低温逆境胁迫处理发现，Sl-WRKY24在干旱、低盐、低温胁迫下表达受抑制。SlWRKY13、 SlWRKY31、 SlWRKY50、 SlWRKY62、SlWRKY63在3种胁迫处理中（SlWRKY50干旱处理除外），虽表达量变化存在差异，但表达量均先升后降。结果表明，这些基因可能参与番茄胁迫处理应答反应。证明WRKY基因家族与植物抗逆胁迫反应关系密切。

选取SlWRKY50基因作功能验证，发现Sl-WRKY50在沉默番茄中通过非生物胁迫处理，表达量下降，说明TRV重组载体已成功转入番茄幼苗，并在植株体内复制表达，该基因参与胁迫应答反应。生理指标是判断植物耐逆重要指标，脯氨酸含量越高，对逆境耐受性越强。植物处于逆境条件下时，细胞会产生大量游离氨基酸[27]，超氧化物歧化酶是一种抗氧化酶，具有增强防御和清除活性氧功能，减弱细胞膜系统损伤，提高植物对逆境胁迫耐受性[28]。本研究中，低温处理1 h后，沉默植株Pro和SOD含量明显低于CK，说明植株沉默后，受低温胁迫损伤较大。低温处理时，细胞可加剧膜脂过氧化，产生大量MDA，其含量可说明膜系统受伤害程度及植物对逆境耐受能力[29]。该试验沉默植株MDA含量明显高于相同条件下未沉默植株。推断SlWRKY50基因沉默后，可降低温度耐受性，说明SlWRKY50基因可能参与低温胁迫应答反应。