曲晓洁 路杰 吴秀英 刘振 李长贵

[摘要]目的

了解过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（Pck1）雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路在高尿酸血症导致胰岛细胞凋亡中的作用。

方法用普通饮食喂养雄性敲除尿酸氧化酶自发高尿酸血症小鼠（SCDKO，n=7）及对照野生型小鼠（SCDWT，n=7），18周时进行葡萄糖耐量试验（GTT），20周时行胰岛素耐量试验（ITT），并检测血清中的尿酸（UA）和空腹胰岛素（FINS）水平，TUNEL染色检测各组胰岛细胞凋亡情况，苏木精伊红（HE）染色观察胰腺细胞的结构及形态，Western blot和RTPCR方法检测各组胰腺组织中PPARγ、Pck1、mTOR蛋白和mRNA表达水平。

结果实验前后SCDKO组小鼠的UA水平显著高于SCDWT组（t=20.67、22.60，P<0.01）;SCDWT组与SCDKO组空腹血糖（FBG）、FINS实验前后差异无显著性（P>0.05）。GTT结果显示，SCDKO组15、30 min时血糖水平较SCDWT组显著升高（t=2.20、2.30，P<0.05），15 min时SCDKO组胰岛素水平较SCDWT组低（t=6.70，P<0.05）。GTT结果显示，两组FINS敏感性差异无显著性（P>0.05）。HE染色显示，SCDKO组胰腺细胞的损害程度较SCDWT组重。与SCDWT组比较，SCDKO组细胞凋亡率升高，差异有统计学意义（t=2.30，P<0.05）。SCDKO组PPARγ、Pck1、mTOR mRNA和蛋白的相对表达量均较SCDWT组升高（t=2.85～6.61，P<0.05）。

结论PPARγPck1mTOR信号通路可能参与了高尿酸血症导致胰岛细胞凋亡的过程。

[关键词]高尿酸血症;过氧化物酶体增殖物激活受体γ;磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶;雷帕霉素靶蛋白;胰岛素分泌细胞;细胞凋亡

[中图分类号]R589.7

[文献标志码]A

[文章编号] 20965532（2018）02013905

多项前瞻性研究证实，血尿酸（UA）水平与2型糖尿病的患病风险密切相关[12]。荟萃分析发现，普通人群中血UA水平每增加60 μmol/L，新发糖尿病的风险增加17%[3]。胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能缺陷是2型糖尿病的主要病因，其中胰岛β细胞凋亡是2型糖尿病的重要促进因素。持续性高尿酸血症引起的胰岛β细胞凋亡和功能异常是导致血糖水平升高的重要原因。动物实验发现，腹腔内注射UA后小鼠糖耐量异常，葡萄糖刺激胰岛素分泌减少，胰岛缩小，胰岛β细胞数量减少。课题组前期研究结果显示，磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（Pck1）可能是高尿酸血症诱导胰岛β细胞凋亡的高度关联蛋白[4]。而Pck1的表达可被过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）诱导，PPARγ还能够调控脂质代谢和糖代谢[5]。而Pck1过表达可以引起细胞内葡萄糖浓度升高，局部高血糖可激活雷帕霉素靶蛋白（mTOR），后者可以引起细胞凋亡。因此，推测UA可能通过诱导氧化应激反应，激活PPARγPCK1mTOR信号通路，促进胰岛β细胞凋亡。本实验研究PPARγPck1mTOR信号通路在高尿酸血症导致胰岛细胞凋亡中的作用，旨在为临床治疗高尿酸血症合并糖尿病病人提供一种新的方法。

1材料和方法

1.1实验材料

UA测定试剂盒（中生北控生物科技股份有限公司，北京）;胰岛素试剂盒（ALPCO公司，美国）;快速血糖仪（东芝公司，日本）;兔抗鼠PPARγ多克隆一抗、兔抗鼠Pck1多克隆一抗以及兔抗鼠mTOR多克隆一抗（伊莱瑞特生物科技股份有限公司，武汉）;兔抗鼠βactin内参（Proteintech，美国）;BCA定量试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）;反转录试剂盒（Takara，日本）;荧光RTPCR试剂盒（SYBR Premix Ex Taq Ⅱ，Takara）;苏木精伊红（HE）染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）;TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（江苏凯基生物技术股份有限公司）。

1.2实验分组与处理

选取8周龄雄性敲除UA氧化酶自发高尿酸血症小鼠（KO）及对照野生型小鼠（WT）小鼠各7只，均普通饲料喂养，分别作为SCDKO组和SCDWT组。将小鼠饲养在无菌通风的笼中，自由饮水、摄食，12 h昼夜循环，室温（22±2）℃。

1.3检测指标及方法

1.3.1小鼠血糖、胰岛素及UA检测小鼠每周禁食不禁水8 h，于次日9：00检测空腹血糖（FBG），隔周检测UA和空腹胰岛素（FINS）;并于喂养18周时进行葡萄糖耐量试验（GTT），20周时行胰岛素耐量试验（ITT）。GTT检测方法：小鼠禁食8 h后腹腔注射D葡萄糖2 g/kg，用快速血糖仪测定0、15、30、60和120 min時的鼠尾血糖。ITT检测方法：小鼠禁食4 h并腹腔注射胰岛素1.0 U/kg，注射后0、15、30、60、120 min时测定鼠尾血糖水平。

1.3.2HE染色检测胰腺病理改变20周后处死小鼠，收集部分胰岛组织，在40 g/L多聚甲醛中固定30 min，-80 ℃冰箱储存。根据HE染色试剂盒说明书染色，显微镜下观察胰腺细胞的形态及结构。

1.3.3TUNEL染色检测细胞凋亡取小鼠胰腺组织石蜡切片，按TUNEL试剂盒说明书操作。免疫荧光显微镜下观察细胞凋亡情况。所有切片在高倍视野下（400倍）拍照，每张切片选择5个胰岛共计200～500个细胞，计数凋亡细胞。

1.3.4RTPCR方法检测PPARγ、Pck1、mTOR mRNA表达取胰腺组织，采用Trizol方法抽提总RNA，反转录试剂盒将mRNA反转录为cDNA，荧光RTPCR试剂盒进行扩增，扩增条件：95 ℃变性，15 s;58 ℃退火，20 s;68 ℃拉伸，20 s;共扩增40个循环。用2-ΔΔCt表示目的基因相对定量。PCR引物及其序列见表1。

1.3.5Western blot方法检测PPARγ、Pck1以及mTOR蛋白表达水平取少量胰腺组织，加入组织3倍体积的蛋白裂解液裂解，取上清液。应用BCA蛋白浓度试剂盒测定PPARγ、Pck1、mTOR蛋白浓度。SDSPAGE电泳，100 ℃水浴锅煮沸蛋白质;待蛋白Marker分离完全，进行Western blot操作。转膜并与抗体杂交：加一抗于封闭液中，4 ℃过夜孵育;第2天洗膜;与二抗反应;于Odyssey红外线荧光扫膜成像仪上计算灰度值。

1.4统计学处理

应用SPSS 18.0软件进行统计学处理，计量资料结果以[AKx-D]±s形式表示，数据间比较采用LSDt检验。以P<0.05表示差异有统计学意义。

2结果

2.1两组小鼠UA、FBG、FINS及GTT结果比较

基础时SCDKO组与SCDWT组FBG、FINS差异无显著性（P>0.05），SCDKO组UA水平高于SCDWT组（t=20.67，P<0.01）;实验20周时（造模后）SCDKO组与SCDWT组FBG、FINS差异无显著性（P>0.05），SCDKO组UA显著高于SCDWT组（t=22.60，P<0.01）。SCDKO组实验前后UA、FBG、FINS水平相比较均差异无显著性（P>0.05）;SCDWT组实验前后UA、FBG、FINS水平比较差异无显著性（P>0.05）。GTT结果显示，SCDKO组15、30 min时血糖水平较SCDWT组均显著升高（t=2.20、2.30，P<0.05），15 min时SCDKO组胰岛素水平较SCDWT组低[（1.02±0.07）μg/L vs （1.35±0.05）μg/L]，差异有显著性（t=6.70，P<0.05）;ITT结果显示，SCDKO组与SCDWT组0、15、30、60和120 min时间点血糖水平差异均无显著性（P>0.05）。见表2、图1。

2.2两组小鼠胰腺组织HE染色结果比较

SCDWT组胰岛细胞呈条索状排列，细胞间有丰富的毛细血管，细胞结构清晰;SCDKO组小鼠胰岛细胞肿胀，轮廓不清，细胞核固缩（图2A、B）。

2.3两组小鼠胰岛细胞凋亡比较

免疫荧光观察显示，凋亡的细胞核呈绿色（图2C、D）。SCDWT组、SCDKO组的胰岛细胞凋亡率分别为（1.93±0.49）%、（6.42±0.62）%，两组比较差异有显著性（t=2.30，P<0.05）。

2.4两组小鼠胰腺组织中PPARγ、Pck1、mTOR mRNA相对表达量比较

与SCDWT组比较，SCDKO组小鼠胰腺组织中PPARγ、Pck1、mTOR的mRNA相对表达量均显著升高（t=2.85～4.39，P<0.05）。見图3、表3。

2.5两组小鼠胰腺组织中PPARγ、Pck1、mTOR蛋白相对表达量比较

与SCDWT组小鼠比较，SCDKO组PPARγ、Pck1、mTOR蛋白相对表达量均升高，差异有统计学意义（t=3.64～6.61，P<0.05）。见图3、表2。

3讨论

近年来，高尿酸血症的患病率越来越高，而血清UA水平升高可使患糖尿病的风险增加[67]。高尿酸血症在2型糖尿病的发生及演变过程中起着重要作用。横断面和前瞻性研究显示，高尿酸血症与葡萄糖代谢紊乱之间有正相关关系[89]。具有稳定的和长寿命的高尿酸血症小鼠模型对于高尿酸血症相关疾病的研究至关重要。本研究通过在C57BL/6小鼠的肝脏中敲除UA氧化酶基因构建了一种新的高尿酸血症小鼠模型用于实验研究。

本文研究结果显示，SCDKO组小鼠实验前后UA水平均显著高于SCDWT组，保证了实验的可行性;SCDKO组与SCDWT组实验前后的FBG、FINS差异均无显著性;ITT结果显示SCDKO组与SCDWT组血糖水平差异无显著性;但GTT结果显示，SCDKO组小鼠在15～30 min时血糖水平明显升高，15 min时的胰岛素水平显著低于SCDWT组，推测葡萄糖代谢紊乱可能与胰岛β细胞分泌的胰岛素不足有关，而非胰岛素抵抗导致糖代谢异常。LU等[4]研究显示，KO小鼠和WT小鼠的ITT实验结果差异无显著性，表明葡萄糖代谢异常不是胰岛素抵抗造成的，可能存在其他的潜在机制。有研究显示，高尿酸血症可能通过降低胰岛素敏感性导致2型糖尿病[1012]。另有研究结果显示，高尿酸血症病人的UA水平对胰岛素敏感指数无明显影响[13]。在葡萄糖耐量减低的高尿酸血症人群中，UA可直接损伤胰岛β细胞的功能[4]。本实验胰腺组织HE染色结果显示，SCDKO组胰腺细胞出现肿胀，细胞间隙不清晰，形状不规则，细胞核固缩;细胞凋亡率明显升高。推测高尿酸血症可能加快了胰岛β细胞的凋亡。LU等[4]研究显示，高尿酸血症可促进腹腔注射链脲佐菌素（STZ）诱导的胰岛细胞凋亡。临床研究发现，确诊时糖尿病病人体内胰岛β细胞数量已经减少50%，而尸检结果显示胰岛细胞的减少主要是β细胞凋亡[14]，说明在血糖升高之前已存在大量胰岛β细胞凋亡。

本文RTPCR结果显示，SCDKO组PPARγ、Pck1、mTOR的mRNA和蛋白表达水平均高于SCDWT组小鼠，提示高尿酸血症可能通过影响PPARγ、Pck1、mTOR基因的表达，促进其蛋白的表达，最终损伤胰岛细胞。还有研究显示，UA经有机阴离子转运体（OAT）进入胰岛β细胞，引发氧化应激，产生大量氧自由基（ROS），而ROS可直接激活PPARγ[15]。PPARγ是一种广泛表达的核受体，主要存在于脂肪、结肠和巨噬细胞[16]。PPARγ与类视色素X受体（RXR）结合构成二聚体，通过调控靶基因表达调控脂代谢和糖代谢[16]。Pck1催化草酰乙酸生成磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）和CO2，是糖异生过程的限速酶。Pck1主要表达在肝、肾和脂肪，正常生理状态下Pck1在成年小鼠胰岛中几乎不表达[17]。Pck1表达可被胰高血糖素、糖皮质激素和cAMP诱导，被胰岛素抑制[18]。Pck1对维持葡萄糖稳态发挥重要作用，Pck1过表达可诱发2型糖尿病。此外，有研究结果显示Pck1的表达可被PPARγ诱导[19]。Pck1过表达可引起细胞内葡萄糖浓度升高，局部高糖血症可激活mTOR，而活

化的mTOR可使胰島素受体底物2（IRS2）丝氨酸/苏氨酸磷酸化，引起IRS2泛素化而被降解，最终导致细胞凋亡[19]。本文的研究结果显示，SCDKO组PPARγ、Pck1、mTOR的mRNA和蛋白相对表达量均升高，提示UA可能通过影响PPARγPck1mTOR信号通路来诱导胰岛β细胞凋亡。有研究表明，高尿酸血症诱发氧化应激反应，产生的ROS可通过抑制NO诱导iNOS表达，iNOS过表达可激活PPARγ诱导Pck1表达，激活mTOR，促使IRS2磷酸化，导致细胞凋亡[20]。iNOS表达升高生成大量NO，引起胰岛β细胞凋亡。

总之，UA可能参与了PPARγPck1mTOR信号通路诱导胰岛细胞凋亡的过程。因此，对于高尿酸血症病人，要积极监测血UA的变化，进行针对性的降UA治疗，以降低UA对胰岛的损害。本研究为高尿酸血症合并糖尿病的精准治疗提供新的靶点和依据，为高尿酸血症的研究开辟了新的思路。但UA对于胰岛细胞凋亡作用的机制还未完全清楚，需进一步的深入研究。

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（本文編辑黄建乡）