任敏 李东霞 杨凌 苏秀兰

010050呼和浩特，内蒙古医科大学附属医院皮肤性病科（任敏、李东霞），临床医学研究中心（杨凌、苏秀兰）

小檗碱为天然中药黄连所提取的生物碱，对皮肤鳞癌［1⁃2］、乳腺癌［3⁃4］、肝癌［5］、结肠癌［6］和神经胶质瘤［7］等恶性肿瘤具有一定的抗肿瘤活性，主要通过抑制增殖、诱导凋亡、抑制转移与侵袭而发挥作用。但对黑素瘤细胞周期阻滞作用的研究极少。我们前期研究证实［8］，小檗碱可抑制人黑素瘤细胞A375细胞增殖，并阻滞细胞于S期和G2/M期。细胞周期蛋白（Cyclin）、细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶（CDK）对细胞周期调控发挥重要作用。根据前期研究、相关文献及miRNA数据库（miRBase、Targetscan human7.1等），我们选择miRNA⁃582⁃5p及其靶基因CDK1，miRNA⁃188⁃5p及其靶基因 CDK2、Cyclin D1、Cyclin A 为研究对象［9⁃10］，通过测定CDK1、CDK2、Cyclin D1、Cyclin A及调节其表达的miRNA，探讨小檗碱对黑素瘤A375细胞周期的影响机制。

一、材料与方法

1.细胞株及主要试剂和仪器：人皮肤黑素瘤A375细胞株（中国科学院上海细胞库）。小檗碱（B325⁃5G）、二甲基亚砜（DMSO）、Trizol试剂（美国 Sigma公司）；胎牛血清、Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）、胰蛋白酶（美国Hyclone公司）；反转录试剂盒、实时定量PCR试剂盒（美国Thermo Fisher Scientific公司）；鼠抗人CDK1、Cyclin A单克隆抗体、兔抗人CDK2单克隆抗体（美国Abcam公司）；Cyclin D1兔抗人单克隆抗体（美国Cell Signaling Technology公司）；荧光二抗（美国Invitrogen公司）；PCR扩增仪7500（美国ABI公司）；Odyssey双色红外激光成像系统（美国LICOR公司）。

2.A375细胞培养及实验分组：用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 mg/L链霉素的DMEM培养基，于37℃、5%CO2饱和湿度细胞培养箱内传代培养A375细胞。取对数生长期细胞，以1.0×105个/ml接种于6孔细胞培养板中，每孔2 ml。培养单层细胞融合度达70%时，分为实验组和空白对照组进行实验，每组设3个复孔。实验组小檗碱浓度分别为 20、40、60、80 μmol/L，空白对照组加等量 DMSO，两组DMSO浓度相等（0.2%），于培养箱培养48 h后进行后续实验。

3.实时定量RT⁃PCR检测miRNA⁃582⁃5p、miRNA⁃188⁃5p及CDK1、CDK2、Cyclin D1、Cyclin A mRNA的表达：收集0、20、40、60、80 μmol/L 小檗碱作用 48 h后的细胞，用Trizol试剂提取细胞总RNA，紫外分光光度仪测定总RNA浓度及纯度，测定A260/A280值在1.8～2.0，1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量。反转录合成cDNA，总反应体系为20 μl（PrimeScrip RT Master Mix 9 μl，总RNA与无核糖核酸酶水共11 μl），反应条件为37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s、4 ℃终止反应，产物置-80℃冰箱待用。实时定量RT⁃PCR扩增miRNA⁃582⁃5p、miRNA⁃188⁃5p、CDK1、CDK2、Cyclin D1、Cyclin A mRNA和内参3⁃磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）、U6，引物序列见表1。G⁃R为miRNA反转录试剂盒中提供的通用引物，序列为 5′⁃GCACTTCAGTGTCGTGGTCAGTGACGGCAATT⁃3′，退火温度为68.5℃。按照SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒说明制备PCR反应体系20 μl。反应条件为：95℃ 10 min；变性95℃15 s，退火1 min（各引物退火温度见表1），延伸72℃30 s，共40个循环；延伸72℃7 min，4℃终止。计算目的基因与内参基因的Ct差值△Ct，以空白组为对照组，计算各试验组目的基因mRNA或miRNA相对表达量（2⁃△△Ct）进行比较。

4.Western印迹检测CDK1、CDK2、Cyclin D1、Cyclin A蛋白水平：将A375细胞分别与0、20、40、60、80 μmol/L小檗碱培养基2 ml作用48 h，提取蛋白，凝胶电泳后将电转到硝酸纤维素膜（NC膜）上。以含5%脱脂奶粉的TBST（含Tris⁃Hcl，Nacl，Tween20）缓冲液室温封闭1 h。一抗（CDK1抗体、CDK2抗体、Cyclin D1抗体、Cyclin A抗体）4℃孵育过夜。继以二抗室温孵育1 h，在暗室内将膜取出，采用Odyssey成像仪成像，Image Studio Lite Ver 3.1图像分析软件分析目的蛋白灰度值，以β肌动蛋白的灰度值为内参，计算CDK1、CDK2、Cyclin D1、Cyclin A蛋白的相对表达量。实验重复3次。

5.统计学分析：用SPSS17.0软件，计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

二、结果

1.A375细胞中miRNA⁃582⁃5p、miRNA⁃188⁃5p及对应靶基因CDK1、Cyclin A、Cyclin D1、CDK2 mRNA含量：与空白对照组相比，20、40 μmol/L小檗碱组miRNA⁃582⁃5p的表达无明显变化，60、80 μmol/L组miRNA⁃582⁃5p的表达上调。随着小檗碱浓度的增加，实验组miRNA⁃188⁃5p表达增强，CDK2、CDK1、Cyclin A、Cyclin D1mRNA 表达逐渐减弱。见表2。

表1 miRNA及细胞周期相关蛋白基因引物序列

表2 不同浓度小檗碱作用A375细胞后各miRNA和对应靶基因mRNA相对表达水平（2⁃ΔΔCt，±s）

表2 不同浓度小檗碱作用A375细胞后各miRNA和对应靶基因mRNA相对表达水平（2⁃ΔΔCt，±s）

注：n=3。a表示与空白对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；b表示与相邻低浓度组间比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。CDK：细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶；Cyclin：细胞周期蛋白

组别空白对照组小檗碱组20 μmol/L 40 μmol/L 60 μmol/L 80 μmol/L F值P值miRNA⁃582⁃5p 1.000±0.000 miRNA⁃188⁃5p 1.000±0.000 CDK1 1.000±0.000 CDK2 1.000±0.000 Cyclin D1 1.000±0.000 Cyclin A 1.000±0.000 1.192±0.052 1.409±0.226 1.791±0.424a 1.925±0.153a 8.945 0.002 1.223±0.052a 1.275±0.121a 1.351±0.053a 1.521±0.062a b 22.600＜0.001 0.825±0.056a 0.636±0.076a b 0.240±0.010a b 0.087±0.004a b 248.510＜0.001 0.718±0.086a 0.596±0.094a b 0.507±0.048a 0.308±0.025a b 51.976＜0.001 0.580±0.036a 0.512±0.008a b 0.421±0.036a b 0.062±0.006a b 626.671＜0.001 0.682±0.068a 0.459±0.046a b 0.163±0.005a b 0.089±0.004a b 312.740＜0.001

2.小檗碱对 CDK1、Cyclin A、Cyclin D1、CDK2蛋白水平的影响：与空白对照组相比，20 ～ 80 μmol/L小檗碱组 CDK1、CDK2、Cyclin D1、Cyclin A蛋白表达显著降低。见表3。

表3 不同浓度小檗碱作用A375细胞后细胞周期相关蛋白相对表达水平（±s）

表3 不同浓度小檗碱作用A375细胞后细胞周期相关蛋白相对表达水平（±s）

注：n=3。a表示与空白对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；b表示与相邻低浓度组间比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。CDK：细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶；Cyclin：细胞周期蛋白

组别空白对照组小檗碱组20 μmol/L 40 μmol/L 60 μmol/L 80 μmol/L F值P值CDK1 0.481±0.084 CDK2 0.601±0.072 Cyclin D1 0.552±0.035 Cyclin A 1.123±0.084 0.252±0.090a 0.009±0.020a b 0.033±0.004a 0.044±0.001a 138.124＜0.001 0.332±0.080a 0.339±0.060a 0.401±0.008a 0.134±0.009a b 110.966＜0.001 0.517±0.050 0.411±0.013a b 0.303±0.040a b 0.318±0.003a 278.772＜0.001 0.882±0.070a 0.719±0.070a b 0.677±0.030a 0.573±0.004a b 140.167＜0.001

三、讨论

黑素瘤是一种具有高度侵袭性、转移性和高致死率的恶性肿瘤。在黑素细胞向黑素瘤细胞转变的过程中，细胞周期及凋亡等状态改变在细胞异常增殖中起到关键作用。已发现细胞周期调控因子有三大类：Cyclin、CDK和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子（CKI）。CDK为整个细胞分裂过程中调控网络的核心，Cyclin与CKI则分别对其进行正性调控与负性调控，进而对细胞周期进程发挥促进与抑制作用［11］。本研究结果显示，小檗碱作用A375细胞后细胞周期相关蛋白CDK1、CDK2、Cyclin D1、Cyclin A表达均下调，提示小檗碱可通过降低细胞周期相关蛋白的表达对黑素瘤A375细胞周期发挥阻滞作用。

miRNA是一种长20～25个核苷酸的非编码单链RNA，通过对靶mRNA的降解或对靶基因的翻译抑制发挥作用。既往研究显示，上调miRNA⁃582⁃5p的表达可以抑制肝癌细胞的增殖［9］，抑制结直肠癌细胞增殖与侵袭［12］，抑制膀胱癌和前列腺癌的生长与转移［13⁃14］。本研究qRT⁃PCR结果显示，随着小檗碱浓度的增加，miRNA⁃188⁃5p表达增加；而小檗碱在20 μmol/L、40 μmol/L浓度下对miRNA⁃582⁃5p的表达无明显影响，在60 μmol/L、80 μmol/L时miRNA⁃582⁃5p的表达上调。研究中发现miRNA变化水平与细胞周期相关mRNA、蛋白表达不完全一致，我们推测在影响CDK1、CDK2、Cyclin D1、Cyclin A mRNA及蛋白的表达中有其他miRNA发挥重要作用。

综上所述，小檗碱通过下调细胞周期相关CDK1、CDK2、Cyclin D1和Cyclin A mRNA的表达，上调抑制mRNA翻译相关的miRNA⁃582⁃5p、miRNA⁃188⁃5p表达，进而降低相应蛋白表达，发挥阻滞细胞周期的作用。

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