陈向齐 林兵 刘志宏 昊霞 宋洪涛 陈胜平

350025福州，厦门大学附属东方医院 解放军福州总医院皮肤科（陈向齐、陈胜平），药学科（林兵、刘志宏、昊霞、宋洪涛）

光动力学疗法用于治疗痤疮疗效显著，副作用小，已成为目前的研究热点。氨基酮戊酸（ALA）经上皮细胞及毛囊皮脂腺吸收后，可以通过血红素合成途径代谢为原卟啉Ⅸ，当光线照射时，PpIX受激发产生单态氧和自由基，使得细胞凋亡，皮脂腺萎缩，痤疮丙酸杆菌被杀灭。Toll样受体（Toll⁃like receptor，TLR）在细胞表面以模式识别受体（pattern recognition receptors，PRR）方式识别细菌脂多糖、脂蛋白和鞭毛蛋白等分子。通过髓样分化因子88（MyD88）依赖和非依赖途径，导致炎症介质如细胞因子、一氧化氮或干扰素产生［1］。但痤疮丙酸杆菌细胞壁表面肽聚糖能否被细胞膜上TLR2受体识别，并通过MyD88依赖的和非依赖的途径产生细胞因子，国内尚未见报道。本研究探讨氨基酮戊酸光动力疗法（ALA⁃PDT）免疫调控作用机制，为阐述TLR2在痤疮天然免疫和获得性免疫中的作用提供理论依据。

资料与方法

一、试剂

含10%胎牛血清DMEM培养基（美国Gibco公司），小鼠巨噬细胞株RAW264.7（上海细胞生物研究所），痤疮丙酸杆菌（ATCC6919）（广东省微生物研究所），厌氧脑心浸液肉汤培养基（青岛海博生物技术有限公司），ALA（上海复旦张江生物医药股份有限公司），肿瘤坏死因子α（TNF⁃α）、白细胞介素6（IL⁃6）试剂盒（上海西塘生物技术有限公司）。抗TLR2抗体（ab⁃16894）、抗MyD88抗体（ab⁃2068）、抗p38抗体（ab⁃31828）、抗p⁃p38抗体（ab⁃207483）、抗JNK抗体（ab⁃176662）、抗p⁃JNK抗体（ab⁃207477）、抗ERK抗体（ab⁃54230）、抗p⁃ERK抗体（ab⁃214362）、抗IκBα抗体（ab⁃5076）、抗p⁃IκBα抗体（ab⁃209942）［艾博抗（上海）贸易有限公司］。

二、方法

1.细胞培养：在37℃、5%CO2培养箱环境下，将小鼠巨噬细胞株RAW264.7接种于培养皿中，用DMEM培养基培养。隔日更换培养基，2～3 d传代1次，处于对数生长期的细胞用于后续实验。

2.灭活细菌液的准备：挑取单个痤疮丙酸杆菌菌落接种于厌氧脑心浸液肉汤培养基中，在37℃厌氧环境下培养3 d，用麦氏比浊法计数，以生理氯化钠溶液调配细菌至1×108细胞/ml，95℃水灭活15 min。

3.实验分组：①空白组为单纯RAW264.7细胞培养；②模型组：按文献［2］，给予终浓度2.25×107个/ml痤疮丙酸杆菌灭活液刺激RAW264.7细胞（2.25×105个/ml）2 h；③0.03 mmol/L ALA组；④0.06 mmol/L ALA组；⑤0.12 mmol/L ALA组。每组实验重复3次，取均值。预实验有单独照光组，实验结果显示和空白组一样，认为单独照光对细胞无影响（数据未显示），故正式实验不设单独照光组。

4.酶联免疫法（ELISA）检测TNF⁃α和IL⁃6浓度：RAW264.7细胞以2.25×105个/ml接种于黑色6孔板（2 ml），置于培养箱培养过夜。除空白组外，其他组给终浓度2.25×107个/ml细菌灭活液（感染复数MOI=100∶1）刺激2 h。ALA终浓度分别为0.03、0.06、0.12 mmol/L，空白组和模型组加等量的PBS液。置于培养箱中培养5 h。给予16 J/cm2红光照射。换1 ml新培养基，培养20 h后取出，收集上清液。按ELISA试剂盒说明书检测TNF⁃α和IL⁃6含量。

5.Western印迹法检测ALA对TLR2、MyD88、p38、JNK、ERK、IκBα表达的影响：细胞培养同上。弃去培养上清液，细胞用PBS液洗涤2次，每孔加入100 μl细胞裂解液，放置5 min，在8 780g下离心15 ～30 min，去上清液，4℃冷却。蛋白定量后，每组分别取20 μg总蛋白，经10%SDS⁃PAGE电泳分离、转膜和4℃封闭过夜，用牛血清白蛋白（BSA）封闭磷酸化抗体。再分别和相应的一抗4℃孵育、过夜。洗膜后分别与辣根过氧化物酶标记的二抗37℃孵育1 h，化学发光法显色，凝胶成像分析系统扫描。

6.统计分析：采用SPSS18.0统计软件进行处理。实验数据以±s表示，各组间计量资料比较采用单因素方差分析，方差齐同时用LSD法，方差不齐时用Tambane′s T2法，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、ALA⁃PDT对痤疮丙酸杆菌刺激RAW264.7细胞分泌细胞因子的影响

1.TNF⁃α：和空白组比较，模型组TNF⁃α浓度升高，差异有统计学意义（P＜0.01），表明炎症模型造模成功。和0.03 mmol/L ALA组、0.12 mmol/L ALA组比较，模型组TNF⁃α浓度升高，差异均有统计学意义（P＜0.01）。0.12 mmol/L ALA组和空白组、模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）；0.12 mmol/L ALA组和0.03 mmol/L ALA组比较，采用单因素方差分析，P=0.440，差异无统计学意义。表明在0～0.12 mmol/L ALA浓度区间内，TNF⁃α和ALA浓度无剂量依赖性（表1）。

2.IL⁃6：和其他组相比，模型组浓度升高（P＜0.05），各组间两两比较，差异有统计学意义（F=114.813，P=0.001）。表明在0～ 0.12 mmol/L ALA浓度区间内，随ALA浓度升高，IL⁃6浓度降低，呈剂量依赖性（表1）。

二、ALA⁃PDT对TLR2、MyD88蛋白表达的影响

模型组TLR2和空白组、0.12 mmol/L ALA组比较、0.06 mmol/L ALA组和空白组比较，P=0.001，差异有统计学意义。0.12和0.03 mmol/L ALA组比较，P=0.011，差异有统计学意义。模型组MyD88和空白组比较、0.06 mmol/L ALA组和空白组比较，差异有统计学意义。0.12和0.03 mmol/L ALA组比较，均P＜0.05，差异有统计学意义。表明在0～0.12 mmol/L ALA浓度区间内，随ALA浓度升高，TLR2、MyD88表达降低，呈剂量依赖性（表2，图1）。

相关性分析显示，TLR2蛋白浓度和上清液中TNF⁃α（r=0.73，P＜ 0.01）、IL⁃6浓度（r=0.92，P＜0.01）存在显著正相关关系。

表1 氨基酮戊酸（ALA）光动力疗法对RAW264.7细胞分泌肿瘤坏死因子（TNF）α、白细胞介素（IL）6的影响（±s）

表1 氨基酮戊酸（ALA）光动力疗法对RAW264.7细胞分泌肿瘤坏死因子（TNF）α、白细胞介素（IL）6的影响（±s）

注：n=3。a和空白组、0.03 mmol/L ALA组、0.12 mmol/L ALA组比较，均P＜0.01；b和模型组比较，P ＜0.01；c和0.03 mmol/L ALA组比较，P ＞0.05；d和空白组、0.03 mmol/L ALA组、0.12 mmol/L ALA组比较，均P＜0.05；e和空白组、0.03 mmol/L ALA组比较，均P＜0.01

组别空白组模型组0.03 mmol/L ALA组0.06 mmol/L ALA组0.12 mmol/L ALA组F值P值TNF⁃α（ng/L）0.24±0.01 0.34±0.02a 0.04±0.01 0.03±0.01 0.03±0.01b c IL⁃6（ng/L）0.01±0.01 0.21±0.03d 0.09±0.01 0.08±0.01 0.07±0.01e 114.81＜0.01

表2 氨基酮戊酸（ALA）光动力疗法对RAW264.7细胞TLR2、MyD88蛋白的影响（±s，A值）

表2 氨基酮戊酸（ALA）光动力疗法对RAW264.7细胞TLR2、MyD88蛋白的影响（±s，A值）

注：n=3。a和空白组、0.12 mmol/L ALA组比较，均P ＜ 0.001；b和0.03 mmol/L ALA组比较，P＜0.05；c和空白组比较，P＜0.01；d和0.03 mmol/L ALA组比较，P＜0.05

组别空白组模型组0.03 mmol/L ALA组0.06 mmol/L ALA组0.12 mmol/L ALA组F值P值TLR2 0.38±0.05 0.90±0.14a 0.85±0.11 0.65±0.03 0.47±0.15b 117.62＜0.01 MyD88 0.20±0.03 1.11±0.13c 0.94±0.02 0.43±0.04 0.27±0.12d 103.21＜0.01

图1 Western 印迹检测TLR2、MyD88、p38、JNK、ERK、IκBα的表达 1：空白组；2：模型组；3：0.03 mmol/L ALA；4：0.06 mmol/L ALA；5：0.12 mmol/L ALA

三、ALA⁃PDT对p38、IκBα、JNK、ERK蛋白的表达及磷酸化的影响

模型组p38、IκBα、JNK、ERK蛋白表达和空白组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），随着ALA浓度升高，以上蛋白表达均无变化。见表3，图1。

表3 氨基酮戊酸（ALA）光动力疗法对痤疮丙酸杆菌刺激RAW264.7细胞表达p38、IκBα、JNK、ERK蛋白及相应的磷酸化蛋白的影响（±s，A值）

表3 氨基酮戊酸（ALA）光动力疗法对痤疮丙酸杆菌刺激RAW264.7细胞表达p38、IκBα、JNK、ERK蛋白及相应的磷酸化蛋白的影响（±s，A值）

注：n=4

组别空白组模型组0.03 mmol/L 0.06 mmol/L 0.12 mmol/L p38 0.48±0.05 0.46±0.22 0.47±0.06 0.48±0.18 0.49±0.11 IκBα 0.39±0.03 0.39±0.06 0.40±0.02 0.41±0.11 0.40±0.12 JNK 0.91±0.23 0.89±0.32 0.93±0.18 0.93±0.21 0.78±0.05 ERK 0.59±0.06 0.57±0.25 0.57±0.11 0.61±0.15 0.62±0.15 p⁃p38 0.15±0.01 0.84±0.04 0.75±0.01 0.31±0.02 0.21±0.02 p⁃IκBα 0.56±0.08 1.45±0.20 1.11±0.28 0.61±0.19 0.47±0.07 p⁃JNK 0.84±0.01 2.56±0.06 2.03±0.05 1.56±0.04 1.03±0.02 p⁃ERK 0.96±0.16 3.70±0.40 3.44±0.48 1.52±0.32 1.05±0.14

模型组p⁃p38、p⁃IκBα、p⁃JNK、p⁃ERK蛋白和空白组比较，表达升高，P＜0.01，差异有统计学意义。随着ALA浓度升高而p⁃p38、p⁃IκBα、p⁃JNK、p⁃ERK蛋白表达降低，呈剂量依赖性（表3，图1）。

讨 论

痤疮丙酸杆菌肽聚糖包含两个甘氨酸残基结合的氨基和羧基功能团形态肽链的交联区域，允许免疫细胞通过 PRP识别［2］。Mochizuki等［3］研究发现，痤疮丙酸杆菌诱导后巨噬细胞TLR2的表达明显增高，从而激活巨噬细胞释放炎症细胞因子IL⁃8、TNF⁃α。本研究结果表明，用痤疮丙酸杆菌灭活液感染RAW264.7细胞，ELISA法检测细胞培养上清液中IL⁃6和TNF⁃α升高。随着ALA浓度升高，IL⁃6水平随着降低，呈剂量依赖性。而TNF⁃α的水平比模型组有所下降，无剂量依赖性。表明ALA⁃PDT治疗能减少TNF⁃α和IL⁃6的分泌，从而减轻炎症。

NF⁃κB 抑制剂（BAY11⁃7802）、ERK 抑制剂（PD98059）、p38抑制剂（SB203580）和JNK抑制剂（SP600125）能够以剂量依赖方式减少核梭杆菌感染的骨髓巨噬细胞分泌IL⁃6和TNF⁃α。有意义的是，NF⁃κB和p38抑制剂能够抑制放线杆菌感染的巨噬细胞分泌IL⁃6和TNF⁃α，而ERK和JNK抑制剂则不能［4］。这些结果表明，巨噬细胞可通过NF⁃κB和MAPKs信号途径直接产生细胞因子。本文结果表明，用痤疮丙酸杆菌刺激小鼠巨噬细胞RAW264.7 细胞后 TLR2、MyD88、p⁃p38、p⁃IκBα、p⁃JNK、p⁃ERK均表达升高，给予不同浓度5⁃ALA⁃PDT治疗后表达降低，随着浓度升高，TLR2、MyD88、p⁃p38、p⁃IκBα、p⁃JNK、p⁃ERK表达下降，呈剂量依赖性，TLR2蛋白表达和上清液中TNF⁃α、IL⁃2的浓度呈正相关。

p38是MAPK家族的重要成员。我们的研究发现，模型组细胞培养上清液中TNF⁃α、IL⁃6显著增高，TLR2蛋白的表达和上清液中TNF⁃α、IL⁃6的浓度呈正相关，提示TLR2参与了痤疮的炎症反应。可能的机制是巨噬细胞细胞膜上TLR2识别痤疮丙杆菌细胞壁上的肽聚糖，诱导单核巨噬细胞经NF⁃кB通路活化细胞内信号转导，合成IL⁃6、TNF⁃α和其他细胞因子，释放到细胞外，引起炎症反应。

综上所述，痤疮丙酸杆菌灭活液可以增加小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞的吞噬活性和TLR2的表达，通过依赖MyD88信号转导通路，引起细胞因子分泌增加。ALA⁃PDT可减少TLR2的表达，通过细胞信号转导通路，引起细胞因子分泌减少，以上发现为ALA⁃PDT治疗痤疮提供了新的思路，可能有助于治疗寻常痤疮新药物的研发。

［1］Kawai T,Akira S.The role of pattern⁃recognition receptors in innate immunity:update on Toll⁃like receptors［J］.Nat Immunol,2010,11（5）:373⁃384.doi:10.1038/ni.1863.

［2］Lee DK,Kim MJ,Ham JW,et al.In vitroevaluation of anti⁃bacterial activities and anti⁃inflammatory effects of Bifido⁃bacterium spp.addressing acne vulgaris［J］.Arch Pharm Res,2012,35（6）:1065⁃1071.doi:10.1007/s12272⁃012⁃0614⁃9.

［3］Mochizuki H,Nomura T,Kawamura I,et al.Enhanced resistance to Gram⁃positive bacterium and increased susceptibility to bacterial endotoxin in mice sensitized withPropionibacterium acnes:involvement of Toll⁃like receptor［J］.FEMS Immunol Med Microbiol,2005,43（2）:287 ⁃293.doi:10.1016/j.femsim.2004.09.009.

［4］Park SR,Kim DJ,Han SH,et al.Diverse Toll⁃like receptors mediate cytokine production byFusobacterium nucleatumandAggregatibacteractinomycetemcomitansin macrophages［J］.Infect Immun,2014,82（5）:1914⁃1920.doi:10.1128/IAI.01226⁃13.