，， ，， (.陆军军医大学陆军卫勤训练基地战救技能训练教研室，重庆 400038；.陆军军医大学大坪医院野战外科研究所第二研究室，创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室，重庆 40004)

抑钙剂(calcilytics)是特异性的细胞外钙敏感受体(calcium sensing receptor，CaSR)的别构抑制剂[1]。CaSR最早发现于牛的甲状旁腺细胞[2]，它在钙代谢相关的组织器官中高表达，如甲状旁腺、肾脏、小肠和骨组织，CaSR在维持体内钙稳态中有重要作用。CaSR的别构激动剂也称为拟钙剂(calcimimetics)，已被欧美国家批准用于临床治疗继发性甲状旁腺功能亢进；相对应的抑制剂也即是抑钙剂，目前用于骨质疏松症的治疗研究中[3-5]。近年来随着研究的深入，人们发现CaSR在心血管系统、脑和神经系统等的器官组织中也有丰富表达和重要功能[6-8]。本实验室前期研究发现，CaSR在血管收缩反应性调节中有着重要作用[9]。但其在休克后心血管功能障碍时的作用如何，目前尚不清楚。本研究通过观察抑钙剂NPS 2143对创伤失血性休克大鼠的存活情况、血压变化及血流动力学指标的影响，初步探讨CaSR在休克后血管功能调节中发挥的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物及试剂

128只清洁级SD大鼠，体质量180～230 g，由陆军军医大学第三附属医院野战外科研究所实验动物中心提供。抑钙剂NPS 2143(Tocris Bioscience，Bristol，UK；Cat.No.3626，Batch No.1B/160801)。

1.2 休克模型制备及实验分组

采用本实验室常规方法制备大鼠创伤失血性休克模型[10]：动物麻醉后，行右侧股骨骨折，通过左侧股动脉插管放血使血压下降至30 mmHg，并维持在此水平2 h，即为休克模型成功。随后通过左侧股静脉插管来复苏给药。96只大鼠用于存活实验，随机分为6组(n=16)：正常组、休克组、乳酸林格氏液(LR)组、LR+NPS 2143 0.1 mg/kg组、LR+NPS 2143 1 mg/kg组、LR+NPS 2143 5 mg/kg组。32只大鼠用于观察血压及血流动力学指标，分为4组(n=8)：正常组、休克组、LR组、LR+NPS 2143 1 mg/kg组。

1.3 观察24 h存活情况

在休克复苏结束后，拔出动静脉插管、结扎止血并缝合伤口，肌肉注射抗生素以预防感染，给予正常饮食，记录每只大鼠的死亡时间，直至复苏后24 h，计算24 h存活率。

1.4 检测血压及升压反应、血流动力学指标

在休克前、休克末、复苏1 h和复苏2 h时相点连续检测各项指标。通过股动脉插管连接水银血压计，记录平均动脉血压(MAP)，通过股静脉插管推注去甲肾上腺素(NE，3 μg/kg)，观察NE诱导的血压升高情况[10]。通过颈动脉插管至左心室、连接压力传感器和生理记录仪，记录各时相点的血流动力学指标：左心室收缩压(left ventricular systolic pressure，LVSP)、心率(heart rate，HR)、左心室压力最大上升/下降速率(maximal change rate of left intraventricular pressure，±dp/dtmax)[11]。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 NPS 2143对THS大鼠存活的影响

创伤失血性休克是一种致死的损伤因素，不进行治疗的休克大鼠平均存活时间仅为3 h左右，且存活均不超过10 h。给予LR复苏能一定程度上提高休克大鼠的存活时间，存活至24 h的大鼠数量为4只(总数16只)。NPS 2143 0.1 mg/kg输注后大鼠的存活情况与LR组相比无明显差异，而NPS 2143 1 mg/kg和5 mg/kg 可明显延长休克大鼠的存活时间，24 h存活大鼠分别为11只和9只，与LR组相比差异有统计学意义(P<0.05～0.01)，见图1a、b。

a:NPS 2143对THS大鼠24 h存活只数的影响；b: NPS 2143对THS大鼠24 h存活时间的影响 *：与正常组比较，P<0.01；#：与LR组比较，P<0.05；△：与LR组比较，P<0.01

图1NPS2143对THS大鼠24h存活数量和存活时间的影响(n=16)

2.2 NPS 2143对THS大鼠血压和升压反应的影响

正常大鼠血压在整个实验过程中无明显变化。休克模型大鼠血压被维持在30 mmHg，模型完成后休克大鼠血压随时间延长进一步降低。LR复苏后休克大鼠的血压有所上升。NPS 2143 1 mg/kg输注可使休克大鼠的血压进一步升高，在复苏2 h时明显高于LR组(P<0.01)。NE诱导的升压反应也显示了相似的变化趋势。休克后NE诱导的血压升幅显著降低，LR复苏有轻度的升高作用，NPS 2143输注对NE的升压效应有明显的改善作用(图2a、b)。

2.3 NPS 2143对THS大鼠血流动力学指标的影响

休克显著降低了大鼠的各项血流动力学指标。LR复苏对各项指标有一定程度的改善作用。1 mg/kg的NPS 2143输注可明显升高休克大鼠的LVSP和±dp/dtmax，在复苏2 h时明显高于LR组(P<0.05)。NPS 2143也使HR有所升高，但与LR组相比无统计学意义(图3a～d)。

a:NPS 2143对THS大鼠血压的影响；b:NPS 2143对THS大鼠血压升幅的影响； *：与正常组比较，P<0.01；△：与LR组比较，P<0.01

图2NPS2143对THS大鼠血压和血压升幅的影响(n=8)

a：LVSP(左心室收缩压)；b：HR(心率)；c：+dp/dtmax(左心室压力最大上升速率)；d：-dp/dtmax(左心室压力最大下降速率) *：与正常组比较，P<0.01；#：与LR组比较，P<0.05

图3NPS2143对THS大鼠血流动力学指标的影响(n=8)

3 讨论

CaSR除了参与钙代谢相关疾病之外，还参与了肾脏疾病、肿瘤、心血管疾病和阿尔茨海默病等多种疾病的病理过程，因此CaSR调节剂在多种疾病治疗中的潜力得到了广泛关注。NPS 2143是第一个被报道的具有口服生物活性的小分子CaSR别构抑制剂(Calcilytics)，其化学结构为N-[(R)-2-hydroxy-3-(2-cyano-3-chlorophenoxy)propyl]-1,1-dimethyl-2-(2-naphthyl)ethylamine[1,12]。NPS 2143能够抑制甲状旁腺中的CaSR活性，促进内源性甲状旁腺激素(PTH)分泌，其早期相关研究的主要目的是开发治疗骨质疏松的口服药物，且目前仍有待进一步的临床验证[13]。CaSR活化突变可引起常染色体相关的低钙血症(ADH)和Bartter综合症(BS5)，这是一类罕见且在临床上缺乏有效治疗措施的疾病，抑钙剂可特异性抑制CaSR活性并纠正受体突变带来的一系列病理改变，动物实验显示NPS 2143对3种模拟人ADH疾病的模型小鼠都有治疗作用，一项小样本临床试验观察了另一种抑钙剂NPSP795对5名ADH患者的疗效，结果提示抑钙剂有可能是ADH和BS5极具潜力的一种治疗手段[14]。

随着心血管系统中存在CaSR被证实，拟钙剂和抑钙剂对心血管功能的影响也逐渐被发现[7,15]。Rybczynska等[16]发现，静脉推注NPS 2143可引起血压正常的Wistar大鼠血压升高，而对切除甲状旁腺的大鼠血压无明显影响，作者推测NPS 2143升高血压的作用可能与甲状旁腺分泌的高血压因子(parathyroid hypertensive factor，PHF)有关。另一项研究显示，阻断钙通道和血管紧张素1型受体(AT1)能抑制NPS 2143升高血压的作用，提示NPS 2143的作用机制可能不局限于调节激素分泌[17]。此外，在关于肺血管平滑肌细胞的研究中，Yamamura[18]发现CaSR参与了肺动脉高压的病理过程，而NPS 2143可阻止肺动脉高压和右心室肥大的发展。但是，与此同时也有一些相关研究，其结果并未发现NPS 2143对血压的调节作用。

前期大量的实验工作显示，复苏2 h后的治疗效果比较明显。复苏后2 h各项指标恢复较好的大鼠绝大多数能存活至24～72 h，而复苏后2 h各项指标较差的大鼠基本上不能存活至24 h，复苏后2 h的大鼠状态能够较好地反映该治疗方法是否有效，因此我们设置复苏后2 h作为重要的检测时相点。本实验结果提示，抑钙剂NPS 2143在低剂量(0.1 mg/kg)时对创伤失血性休克大鼠存活情况的影响与单纯给予LR复苏的效果相似，而中、高剂量的NPS 2143(1和5 mg/kg)都有较明显的延长休克动物存活时间和提高24 h存活只数的作用，其治疗效果显著优于单纯LR复苏，在两者之中，1 mg/kg剂量组略优于5 mg/kg剂量组。进一步的实验显示，NPS 2143(1 mg/kg)能够升高休克大鼠的血压，增加NE诱导的升压反应，改善休克后血流动力学指标(包括LVSP和±dp/dtmax)，其作用明显优于LR组。

前期对离体血管的研究结果显示，拟钙剂cinacalcet能诱导内皮完整的预收缩的血管产生舒张，提示CaSR在血管舒缩调节中发挥着一定作用[9]。结合本实验结果，可以推测CaSR在休克后血管功能调节中发挥了重要作用，CaSR抑制剂NPS 2143有较好的休克治疗作用。抑钙剂发挥作用的机制可能是通过抑制CaSR，改善休克导致的血管平滑肌细胞钙超载，进而发挥血管细胞保护作用，但剂量过高时可能引起过度抑制，过度降低细胞内钙水平，从而影响血管收缩功能。另外，随着药物剂量的增加，可能出现的副作用也会对总体治疗效果产生影响。综上所述，CaSR对血管张力和血压调节是多靶点、多机制共同作用的复杂过程，其具体的调节机制仍需要进一步研究。

[参考文献]

[1] Nemeth EF,Goodman WG.Calcimimetic and calcilytic drugs: feats,flops,and futures[J].Calcif Tissue Int,2016,98(4):341-358.doi: 10.1007/s00223-015-0052-z.

[2] Brown EM,Gamba G,Riccardi D,et al.Cloning and characterization of an extracellular Ca2+-sensing receptor from bovine parathyroid [J].Nature,1993,366(6455):575-580.doi:10.1038/366575a0.

[3] Vahe C,Benomar K,Espiard S,et al.Diseases associated with calcium-sensing receptor[J].Orphanet J Rare Dis,2017,12(1):19.doi: 10.1186/s13023-017-0570-z.

[4] Cozzolino M,Galassi A,Conte F,et al.Treatment of secondary hyperparathyroidism: the clinical utility of etelcalcetide[J].Ther Clin Risk Manag,2017,13:679-689.doi: 10.2147/TCRM.S108490.

[5] Díaz-Soto G,Rocher A,García-Rodríguez C,et al.The calcium-sensing receptor in health and disease[J].Int Rev Cell Mol Biol,2016,327:321-369.doi: 10.1016/bs.ircmb.2016.05.004.

[6] Chiarini A,Armato U,Liu D,et al.Calcium-sensing receptors of human neural cells play crucial roles in Alzheimer's disease[J].Front Physiol,2016,7:134.doi: 10.3389/fphys.2016.00134.

[7] Schepelmann M,Yarova PL,Lopez-Fernandez I,et al.The vascular Ca2+-sensing receptor regulates blood vessel tone and blood pressure[J].Am J Physiol Cell Physiol,2016,310(3):C193-C204.doi: 10.1152/ajpcell.00248.2015.

[8] Smith KA,Ayon RJ,Tang H,et al.Calcium-sensing receptor regulates cytosolic [Ca2+] and plays a major role in the development of pulmonary hypertension[J].Front Physiol,2016,7:517.doi: 10.3389/fphys.2016.00517.

[9] 彭小勇,李 涛,刘良明,等.CaSR在大鼠血管收缩/舒张反应性调节中的作用[J].局解手术学杂志,2016,25(9):629-631.doi: 10.11659/jjssx.04E016053.

[10] Yang GM,Peng XY,Hu Y,et al.4-phenylbutyrate benefits traumatic hemorrhagic shock in rats by attenuating oxidative stress,not by attenuating endoplasmic reticulum stress[J].Crit Care Med,2016,44(7):e477-491.doi: 10.1097/CCM.0000000000001469.

[11] 杨光明,彭小勇,李 涛,等.环孢素A对严重创伤失血性休克大鼠的治疗作用[J].局解手术学杂志,2014,23(3):250-252.doi: 10.11659/jjssx.1672-5042.201403011.

[12] Nemeth EF,Delmar EG,Heaton WL,et al.Calcilytic compounds: potent and selective Ca2+receptor antagonists that stimulate secretion of parathyroid hormone[J].J Pharmacol Exp Ther,2001,299(1):323-331.

[13] Widler L.Calcilytics: antagonists of the calcium-sensing receptor for the treatment of osteoporosis[J].Future Med Chem,2011,3(5):535-547.doi: 10.4155/fmc.11.17.

[14] Mayr B,Glaudo M,Schöfl C.Activating calcium-sensing receptor mutations: prospects for future treatment with calcilytics[J].Trends Endocrinol Metab,2016,27(9):643-652.doi: 10.1016/j.tem.2016.05.005.

[15] Colella M,Gerbino A,Hofer AM,et al.Recent advances in understanding the extracellular calcium-sensing receptor[J].F1000 Res,2016,5.pii: F1000 Faculty Rev-2535.doi: 10.12688/f1000research.8963.1.

[16] Rybczynska A,Lehmann A,Jurska-Jasko A,et al.Hypertensive effect of calcilytic NPS 2143 administration in rats[J].J Endocrinol,2006,191(1):189-195.doi: 10.1677/joe.1.06924.

[17] Rybczynska A,Jurska-Jasko A,Boblewski K,et al.Blockade of calcium channels and AT1 receptor prevents the hypertensive effect of calcilytic NPS 2143 in rats[J].J Physiol Pharmacol,2010,61(2):163-170.

[18] Yamamura A.Pathological function of Ca2+-sensing receptor in pulmonary arterial hypertension.J Smooth Muscle Res,2014,50:8-17.doi:10.1540/jsmr.50.8.