林立鹏 刘泽滨 吴晓宾

子宫内膜异位症(Endometriosis)是一种妇科常见病，但目前对其发病机制没有较好的叙述，不过目前认为其依赖于血管生成和血液供应[1]。目前对子宫内膜异位症的发病机制进行深入研究，而随着研究不断进行，社会各界基本已经认定了子宫内膜种植学说。桂枝茯苓丸本身具有活血化瘀功效，用于子宫内膜异位症治疗，但其具体作用机制不明[2]。本研究主要通过大鼠在服用桂枝茯苓丸后体内VEGF和HIF-1α变化情况，进行桂枝茯苓丸作用机制研究。

1 实验材料

1.1 药物和试剂

桂枝茯苓丸：由桂枝、牡丹皮、桃仁、茯苓、赤芍各9 g构成[3]。

孕三烯酮：孕三烯酮胶囊(北京紫林药业有限公司，2.5毫克/粒，批号：国药准字H19980020)。

1.2 实验对象

雌SD大鼠共40只，均选自上海斯莱克实验动物有限公司，许可证号SCXK(沪)2007-0005，饲养环境温度在25 ℃，相对湿度60%，大鼠均自由进食、饮水[4]。饲养足月后，确保大鼠体重在180～200 g，建立大鼠子宫内膜异位症模型，此外无其他疾病，且大鼠均能正常摄取药物。

1.3 仪器

电子天平(德国)、BX41型显微镜(日本)和ABI7500型实时定量PCR仪(美国)。

2 方法

2.1 造模分组以及给药

共40只大鼠，其于按照标准分为4组。模型对照组不给予任何药物；低剂量桂枝茯苓丸组每天给予0.5 g桂枝茯苓丸；高剂量桂枝茯苓丸组每天给予3.0 g桂枝茯苓丸；孕三烯酮组每天给予孕三烯酮2 g。其中桂枝茯苓丸ig,1天1次；孕三烯酮,ig，1周2次，共治疗4周。治疗4周后，将所有大鼠全部处死，并获取每个大鼠异位子宫内膜，将所有标本分为2份，进行PCR检测[5]。

2.2 VEGF含量测量

采用ELISA法，处死大鼠后，切开腹膜，往大鼠腹腔内注入生理盐水，摇动大鼠，直至腹腔全部充满。收集灌洗液，在4 ℃和500 r/min环境下离心10 min，利用上层清液测定VEGF含量[6]。

2.3 HIF-1α中mRNA的表达检测

采用PCR法。将内膜组织放入玻璃匀浆器，研磨至出浆。加入微量三氯甲烷，震荡后静置，在4 ℃和12 000 r/min环境中离心10 min。将上层清液移至新EP管中，加入异丙醇，混匀后静置10 min，再次离心15 min，弃上清液。向沉淀物中加入1 mL DEPC水和乙醇混合液，再次离心，弃上清液。自然干燥后加水溶解，冷冻存储[7]。

2.4 PCR检测

根据实际和说明书，可得到下列引物列表，见表1。

表1 引物序列

2.5 统计学方法

3 结果

3.1 各组大鼠VEGF表达

模型对照组VEGF阳性率表达最高，而高剂量桂枝茯苓丸VEGF阳性率表达最低，见表2。

表2 各组大鼠VEGF表达 (%)

注：1)数据明显高于其他组，P<0.05；2)数据明显低于其他组，P<0.05

3.2 各组大鼠HIF-1α表达

模型对照组HIF-1α最高，高剂量桂枝茯苓丸HIF-1α最低，见表3。

组别nHIF-1α模型对照组10139±271)低剂量桂枝茯苓丸10109±13高剂量桂枝茯苓丸1082±142)孕三烯酮组10114±8

注：1)数据明显高于其他组，P<0.05；2)数据明显低于其他组，P<0.05

4 讨论

随着分子生物学的发展出现，血管生成理论得到进一步发展，越来越多证据表明血管生成在子宫内膜的生长修复中起到很大作用，而且在子宫内膜异位症的治疗和发展中占据重要位置[8]。新生血管可以为子宫内膜异位病灶提供所需氧气和营养物质，血管生成是子宫内膜病灶增殖和种植的必要条件。单核巨噬细胞在免疫反应中起到重要作用，能够反馈免疫应答。当外来细胞进入人体后，单核巨噬细胞提供识别作用，也为向T细胞提呈抗原作用。在腹腔当中，巨噬细胞会通过自身功能对外来细胞进行消除，以及对细胞碎片进行吞噬。在本次实验研究中，可以发现巨噬细胞数量明显增加，当其功能被过度激活时，TNF-α、IL-8和VEGF水平也会大幅度增加。在后续研究中发现，影响腹腔中子宫内膜上巨噬细胞增多的原因有以下几个方面： ①子宫内膜异位患者腹腔液成分与正常人有所差异，极有可能导致巨噬细胞活性程度增加；②子宫内膜异位组织分泌的活性物质导致巨噬细胞活性增强。而且在子宫内膜异位患者当中，巨噬细胞凋亡率会大大降低，而且生命周期会出现一定程度改变。在基因表达中，Bcl-2基因表达大大增强，而Bax基因表达受到抑制，会使细胞抗凋亡能力进一步增加。

IL-8与VEGF类似，都是单核巨噬细胞分泌的一种细胞因子。血管新生本身具备多个复杂步骤，需要多个生长因子和细胞因子参与，特别是VEGF，是刺激生长的关键因子[9]。在本次研究中发现，患有子宫内膜异位症大鼠腹腔液中VEGF的含量明显高于正常大鼠。而且根据之前研究显示[10-11]，子宫内膜异位症严重程度与腹腔液中分泌的VEGF含量呈正相关，而本次实验中，模型对照组VEGF阳性率表达最高，而高剂量桂枝茯苓丸VEGF阳性率表达最高，而且经过桂枝茯苓丸28 d治疗后，子宫内膜异位症大鼠腹腔液中VEGF含量出现下降趋势。其次，在HIF-1α的mRNA检测中发现，桂枝茯苓丸可以抑制VEGF表达。

桂枝茯苓丸是一种中成药，也是一种理血剂，具有活血、化瘀、消癥等功效。该药物主要包含桂枝、茯苓、丹皮、桃仁、芍药等中药材，其中桂枝主要可以能够散寒止痛、温经驱寒、活血化瘀、温养经络；茯苓可以健脾静心、利水渗湿，有利于腰脐间血；丹皮、芍药、桃仁也可以帮助患者活血化瘀，此外芍药还具有养血活血的功效。子宫内膜异位症会经历一个缺氧环境，在HIF-1α和VEGF形成的通路之下，降低氧含量会促进血管生成因子的出现。而且在氧气不足的条件下，环境会促进VEGF表达，而桂枝茯苓丸会调整异位病灶中HIF-1α表达水平。

子宫内膜异位症在转移这一特点上与恶性肿瘤类似，其中，细胞基质的降解和重建是关键因素。桂枝茯苓丸是治疗子宫内膜异位症的传统中药方，无论是单独使用还是与西药结合使用，均能取得良好的治疗效果，在短时间减轻/缓解内子宫内膜异位症患者疼痛，缩小内膜异位肿块。此外，桂枝茯苓丸还能够有效缩小异位内膜组织。桂枝茯苓丸被患者服用后，可让患者前列腺素得到有效平衡，缩小与正常人前列腺素差距。而且桂枝茯苓丸还有一定缓解子宫平滑肌痉挛的作用。在子宫内膜异位患者中，桂枝茯苓丸能直接明显的降低MMP-2和MMP-9在子宫内膜异位组织中的表达，之后可以抑制子宫异位内膜的侵袭、转移和种植，从根本上解决子宫内膜异位症的致病原因，也从侧面反应出子宫内膜异位症多靶点特点。

孕三烯酮(Gestrinone)是一种中等强度激素类药物，具有很强的抗雌激素活性和抗孕激素活性的作用，主要通过抗雌激素的方式治疗子宫内膜异位症，约束病灶生长。在研究中发现，孕三烯酮能降低VEGF表达，限制病灶增长，其整体水平超过低剂量桂枝茯苓丸，但明显低于高剂量桂枝茯苓丸。但孕三烯酮却无法抑制HIF-1α表达，故而整体治疗效果要低于大剂量桂枝茯苓丸。此外，在其他研究中还发现，其作用类似于黄体酮，均会使子宫内膜失活并退化。通过以上结果，可以分析出，桂枝茯苓丸和孕三烯酮本身作用机制存在一定差异，桂枝茯苓丸不仅能够降低VEGF水平，还能够减少HIF-α表达，阻碍子宫内膜异位病灶区生长，使其内部血管生成出现阻碍，抑制子宫内膜异位症病情发展。而桂枝茯苓丸还具有一定对雌激素和免疫系统调节的作用，但更深层的作用机制还有待研究。

综上所述，桂枝茯苓丸能抑制子宫内膜异位症血管生成，其机制与抑制VEGF和HIF-1α有关。

[1] 崔明华,李龙珠,刘家军,等.桂枝茯苓丸对子宫内膜异位症模型大鼠血管内皮生长因子表达的影响[J].实用药物与临床,2015,18(9):1023-1026.

[2] LOUSSE J C, DEFRERE S, VAN-LANGENDONCKT A, et al.Iron storage is significantly increased in peritoneal macrophages of endometriosis patients and correlates with iron overload in peritoneal fluid[J].Fertil Steril,2009,91(5):1668-1675.

[3] 赵淑英.桂枝茯苓丸联合腹腔镜电凝术对子宫内膜异位症患者术后血清GSH-Px、Leptin水平及妊娠率的影响[J].中国临床实用医学,2017,8(4):40-42.

[4] 常卓琳.桂枝茯苓丸辅助治疗对子宫内膜异位症患者血清瘦素、血管内皮生长因子、白细胞介素-8及卵巢功能的影响[J].现代中西医结合杂志,2016,25(35):3915-3917.

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[8] MANETTA L A, DE PAULA MARTINS W, ROSA E SILVA J C, et al. Uterine ultrasonographic changes during endometriosis treatment: a comparison between levonorgestrel-releasing intrauterine devices and a gonadotropin-releasing hormone agonist[J].Ultrasound Med Biol,2008,34(12):1914-1918.

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