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利什曼原虫所致的利什曼病，可分为内脏利什曼病(又称为黑热病)、黏膜皮肤利什曼病和皮肤利什曼病。引起不同临床类型的利什曼原虫在形态结构上没有明显差别，传统方法对虫株的鉴别主要依靠流行病学及临床资料[1]。基于分子研究的方法已被广泛运用于微生物和寄生虫的分类，相别于传统方法，具有快速、准确，且可与国内外数据比对构建进化关系的特点。SSU rRNA是真核生物一个较保守的基因，但在原虫的不同种间的变异比原核生物还要大，可用于原虫种属之间亲缘关系的研究[2-3]。本文研究分析了陕西省韩城市利什曼原虫标本的SSU rRNA基因片段，与国内外发表的该基因数据库进行比对，从分子水平确立陕西省利什曼原虫种属分类地位。

1 材料与方法

1.1 陕西省利什曼原虫阳性标本

1.1.1虫株标本 采集病犬及病例骨髓标本，以NNN培养基25 ℃进行培养，第10 d收集培养液镜下观察，发现有前鞭毛体存在者为培养阳性。取培养液用QIAamp DNA Mini Kit(Qiagen公司生产)提取基因组DNA。

1.1.2病例标本 3例有黑热病疫区接触史，症状典型的病例，取骨髓穿刺液，瑞氏染色，镜下观察发现典型利杜体者为阳性，取骨髓液用QIAamp DNA Mini Kit提取基因组DNA。

1.1.3媒介标本 采集病区白蛉标本，单只装管，冷冻研磨砂，以天隆动物组织基因组核酸提取试剂盒(西安天隆公司生产)提取基因组DNA，以kDNA引物RV1、RV2及K13A、K13B[4]扩增阳性者作为媒介感染的阳性标本。

1.2 SSU rRNA基因序列扩增及测序

1.2.1SSU rRNA引物及扩增条件 参照文献[5]，研究序列SSU rRNA的上游引物为R222：TATTGGAGATTATGGAGCTG；下游引物R333：AAAGCGGGCGCGCGGTGCTG。……