柴艳兵，李兴佳，张耀广，李飞，屈雅莉，杨春杰

(君乐宝乳业集团质量管理中心石家庄050021)

0 引言

乳品中污染的微生物主要有霉菌、酵母菌和细菌。酸奶中较低的pH值能够抑制细菌的生长，但也为酵母菌的生长提供了有利的条件，因此，酵母菌的污染成为引起酸奶变质的主要菌群[1]。已有多名学者对酸奶中污染微生物进行研究，表明酵母菌能够很大程度上引起酸奶的胀包[2-5]。酵母菌的污染主要来源于车间的生产环境，但酵母菌在车间的具体分布情况，及产品中污染酵母菌的溯源，却研究甚少。

26S rDNA D 1/D 2区域序列高度变异性的特点，使其成为有效的酵母菌种级水平鉴定方法[6-7]，许多学者利用26S rDNA D 1/D 2区域对食品中的酵母菌进行鉴定，从而确定优势菌群[8-11]。本文以酸奶生产车间和30℃保温库中的胀包酸奶为研究对象，通过利用空气沉降法、表面涂抹法和划线分离法，利用26S rDNA D 1/D 2基因序列，对分离出的酵母菌进行分类鉴定，确定车间环境中酵母菌的分布及胀包产品中酵母菌的种类，通过溯源研究，为车间消毒杀菌的关键控制点提供理论依据，为产品中酵母菌污染的防治提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料和设备

孟加拉红培养基，麦芽浸粉肉汤，TIANam p Yeast DNA Kit酵母基因组DNA提取试剂盒（离心柱型），Taq PCR M asterm ix，DNA M arkerⅢ，琼脂糖凝胶，无水乙醇，溶菌酶，引物N L1：5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'，N L4：5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'。

生化培养箱，电泳仪，PCR仪，压力蒸汽灭菌器，恒温水浴锅，超净工作台，凝胶成像系统。

1.2 试验方法

1.2.1 酸奶生产中酵母菌的分布研究

1.2.1.1 采样时间：灌装区每天进行一次监测，其他区

域每周进行一次监测，监测周期为12个月。

1.2.1.2 采样地点及方法

(1)采样地点：配料区、热处理间、巴杀区、接种区、发酵区、待装区、灌装区。

采样方法：采用自然沉降法，将孟加拉红琼脂平板放置距离地面1m左右的监测点，暴露15m in后合上盖子，将平板倒置于28℃生化培养箱培养5 d。

(2)设备管路及表面：待装罐内壁、巴杀杀菌机出口管路内壁、灌装机成型器、灌注头、膜轴。人员手部：测酸人员、灌装机手、配料人员。

采样方法：将灭菌的涂抹棒用灭菌的生理盐水润湿，在被涂抹物表面迅速擦拭100 cm2，立即均匀的涂抹在孟加拉红琼脂平板上，将平板倒置于28℃生化培养箱培养5 d。

1.2.1.3 菌株的分离鉴定

收集所有的平板，挑取平板上不同形态的细菌菌落，接种于麦芽浸粉肉汤培养基中培养48 h后，根据酵母菌基因组DNA提取试剂盒说明书进行DNA的提取。

PCR反应体系为：Taq PCR M asterm ix 25μL，正向引物N L1 1μL，反向引物N L4 1μL，DNA模板1μL，ddH2O 19μL。

PCR反应条件为：预变性94℃5 m in；30个循环，94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 60 s；72℃延伸10 m in；4℃保温。扩增完毕后，取5μL PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。选择600 bp左右可见清晰条带的扩增产物测序。

将测序序列在NCBI上Blast比对，获取与所测序列相似度高的序列，确定菌株的分类地位。

1.2.2 产品中酵母菌的污染研究

收集30℃保温库中胀包的酸奶，从胀包中挑取一环划线接种于孟加拉红培养基平板上，将平板倒置于28℃生化培养箱培养5 d后，按照1.2.1.3步骤进行菌株的鉴定。

2 结果与分析

2.1 酸奶生产中酵母菌的分布

通过空气沉降和设备涂抹法对酸奶生产中分离的酵母菌落进行菌株鉴定，得到系统分类地位。由表1可以看出，空气环境中共分离出132株酵母菌，共7个属，分别为假丝酵母属(Candida spp.)、棒孢酵母属(C lavispora spp.)、红酵母属(Rhodotorula spp.)、囊酵母属(Zygoascus spp.)、丝孢酵母属(Trichosporon spp.)、铁艾酵母属(Tilletiopsis spp.)、隐球酵母属(C ryptococcus spp.)。在设备表面及人员手部涂抹中，仅在灌装机分离到一株酵母菌，为红酵母属(Rhodotorula spp.)，结果表明，酵母菌在设备表面上存在较少，大部分都存在在空气中。因此，空气的清洁度决定了酵母菌在车间的污染程度。

2.2 生产环境中不同酵母菌的污染比例

由图1可知，在酸奶生产环境中，不同酵母菌的存在比例依次为：热带假丝酵母(Candida tropicalis)（21.05%）、阿氏丝孢酵母(T richosporon asahii)（16.54%）、中间假丝酵母(Candida intermedia)（12.03%）、产朊假丝酵母(Candida utilis)（8.27%）、葡萄牙棒孢酵母(C lavispora lusitaniae)（8.27%）、拟平滑念珠菌(Candida orthopsilo-sis)（7.52%）、C ryptococcus friedmannii（7.52%）、Tilletiopsis albescens（6.77%）、C ryptococcus saitoi（3.76%）、胶红酵母(Rhodotorulamucilaginosa)（3.01%）、大隐球酵母(C ryptococcus magnus)（2.26%）、小红酵母(Rhodotorula minuta)（1.50%）、Zygoascusmeyerae（0.75%）、T richosporon coremiiforme（0.75%）。假丝酵母属(Candida spp.)占总数的48.87%，为空气中酵母菌的优势菌群。

2.3 产品中酵母菌的污染研究

通过对32个胀包产品中污染的酵母菌进行鉴定（表2），结果表明，引起产品胀包的酵母菌种类稳定，主要为假丝酵母属(Candida spp.)、棒孢酵母属(C lavispora spp.)和W ickerhamomyces spp.。共分离得到5种酵母菌，分别为中间假丝酵母(Candida intermedia)、葡萄牙棒孢酵母(C lavispora lusitaniae)、产朊假丝酵母(Candida utilis)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、异常威克汉姆酵母(W ickerhamomyces anomalus)，引起胀包比例为56.25%、15.63%、12.505%、9.38%、6.25%。

由表1可以看出，中间假丝酵母(Candida intermedia)存在于配料区、灌装区、灌装机膜仓和包材间，葡萄牙棒孢酵母(C lavispora lusitaniae)仅存在于灌装区和包材间的空气中，产朊假丝酵母(Candida utilis)存在于配料区、灌装区和包材间空气中，热带假丝酵母(Candida tropicalis)主要存在于灌装区、灌装机膜仓和包材间的空气中。4类污染酵母菌在灌装区数量最多，其次为包材间，因此，产品中酵母主要是通过灌装间的空气和包材间的空气污染的。加强灌装间和包材间空气质量的消毒清洁，是防止酵母菌污染产品的关键控制点。

引起产品污染的异常威克汉姆酵母(W ickerhamomycesanomalus)在车间环境中没有分布，推测可能是由于包装材料表面自身带菌而引起产品的污染。因此，加强车间环境控制的同时，应严格控制包装材料的微生物质量，以杜绝由包材导致的产品问题。

3 结论与讨论

引起酸奶胀包的主要微生物为大肠菌群和能够发酵产气的酵母菌。由于大肠菌群在较低的pH值环境下很难生长，而酵母菌在3.0～7.5的范围内均可生长，其最适PH值为4.5～5.0，因此，酸奶中酵母菌的污染，受到所有企业的重点关注。本文通过对车间环境中酵母菌的分布和污染产品的酵母菌研究，建立酵母菌的关键污染途径，为产品中酵母菌污染的防控措施提供重要的依据。

通过本文可知，空气环境中存在的酵母菌共7个属，分别为假丝酵母属(Candida spp.)、棒孢酵母属(C lavispora spp.)、红酵母属(Rhodotorula spp.)、囊酵母属(Zygoascus spp.)、丝孢酵母属(Trichosporon spp.)、铁艾酵母属 (Tilletiopsis spp.)、隐球酵母属(C ryptococcus spp.)。污染产品的微生物主要为假丝酵母属(Candida spp.)、棒孢酵母属(C lavispora spp.)和W ickerhamomyces spp.，其中，假丝酵母属(Candida spp.)污染比例高达78.13%，与车间酵母菌属的分布比例相符，说明产品中大部分的污染微生物来自于车间的环境。

表1 车间环境中酵母菌的分布

图1 生产环境中不同酵母菌的污染比例

表2 产品中污染酵母分类及比例

在5种污染酵母菌中，前4种分布在配料区、灌装区、灌装机膜仓和包材间中，根据酸奶的生产工艺，配料完成后会进入巴氏杀菌程序，因此，配料区存在的酵母菌不足以引起产品的污染，最主要的污染途径有2种，一种是灌装车间的空气带入的污染，一种是包装车间的空气间接引起的污染。由于包装材料能直接接触到产品，包材间的空气质量，也必须引起重视，不能疏忽。

食品生产车间常用的空气消毒方法有空气过滤、紫外线消毒、臭氧消毒、熏蒸消毒、双氧水消毒、化学气溶胶喷雾消毒、静电吸附等，每种办法都有其适用的范围和使用的局限性[12]，因此选用合适的消毒方法对酵母菌的控制起到关键性作用。由于灌装车间和包装材料都会直接接触产品，建议使用经济、安全、无害的消毒剂，如食品级双氧水，不含有毒有害杂质，用喷雾器将消毒溶液喷洒在空气中，即可起到对生产空间消毒的效果[13]。同时加大对灌装车间和包材间的消毒频次，以降低酵母菌的扩散与繁殖。

在对车间环境进行严格管控的同时，已有部分学者开始寻找能够有效抑制酸奶中霉菌和酵母菌的益生菌[14-16]。通过车间环境消毒和优良菌种的筛选，可以有效的解决酸奶中酵母菌的污染问题。

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