任明亮，李辉，刘冬斌，陈国雄，谭镇南，刘鹄(南方医科大学附属南海医院，广东佛山528200)

骨肉瘤是一种多发于青少年的原发恶性骨肿瘤，易发生肺转移[1～3]。近年来骨肉瘤的治疗已进入瓶颈期，患者5年生存率一直没有得到明显提高。微小核糖核酸(miRNA)是由20～25个核苷酸组成的单链非编码小RNA，通过结合靶基因的3′UTR区而抑制其表达，参与细胞分化、增殖、程序性死亡等多种重要生理过程[4]。miR-196a是近期发现的miRNA家族重要成员之一，其在喉癌[5]、结肠癌[6]、食管癌[7]等多种恶性肿瘤中表达失调。但目前miR-196a在骨肉瘤细胞中的表达变化及其对骨肉瘤细胞恶性生物学行为影响的研究较少。为此，我们于2016年12月～2017年7月进行了如下研究，以期为骨肉瘤的发病机制和靶向治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料 动物：SPF级BALB/c雄性裸鼠12只，4～6周龄，体质量16～20 g，购自北京维通利华动物实验中心。细胞：人骨肉瘤细胞系MG-63及人成骨细胞hFOB1.19均购自美国ATCC公司。主要试剂：TRIzol Reagent、LipofectamineTM2000均购自美国Invitrogen公司；逆转录试剂盒、实时荧光定量PCR试剂盒均购自日本Takara公司；miR-196a inhibitor、阴性对照inhibitor-NC、miR-196a特异性引物和内参U6均由广州锐博生物有限公司设计合成；叉头框蛋白1(FOXO1)、GAPDH引物均由上海生工生物工程有限公司设计合成；CCK-8试剂盒购自江苏碧云天生物技术研究所；Anexin-FITC/PI凋亡试剂盒购自南京凯基生物公司；一抗FOXO1和GAPDH抗体购自美国Santa Cruz公司，二抗购自武汉博士德生物技术有限公司。

1.2 骨肉瘤细胞及成骨细胞miR-196a表达检测 采用实时荧光定量PCR法。MG-63细胞及hFOB1.19细胞均采用RPMI 1640培养基(含10%胎牛血清)置于5% CO2、37 ℃、饱和湿度的恒温培养箱中培养。取对数生长期的MG-63细胞及hFOB1.19细胞，按照说明书用TRIzol试剂提取总RNA，琼脂糖凝胶电泳法检测RNA完整性。将总RNA按逆转录试剂盒说明书操作逆转录合成cDNA，以cDNA为模板，参照实时荧光定量PCR试剂盒说明书，应用PCR仪进行定量检测。引物序列：miR-196a 正向引物：5′-GCTCTGGCTCCGTGTCTTCACTCCC -3′，反向引物：5′-TGCCCCAGCACAGCCCCCGTCCCTC-3′；内参U6 正向引物：5′-CATTGGCTTCGGCAGCACATATAC-3′，反向引物：5′-CAGGCTTGAATTTGCGTGTCATCC-3′。PCR反应条件：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s， 60 ℃退火34 s，共40个循环。以U6作为内参，采用2-ΔΔCt法计算 miR-196a相对表达量。结果显示，MG-63细胞及hFOB1.19细胞miR-196a相对表达量分别为8.70±0.42、1.01±0.05，二者比较P<0.05。

1.3 miR-196a对MG-63细胞增殖、凋亡及成瘤能力影响的观察

1.3.1 细胞分组处理 取对数生长期MG-63细胞，随机分为miR-196a inhibitor组和inhibitor-NC组，采用LipofectamineTM2000按照说明书操作分别转染miR-196a inhibitor和inhibitor-NC。转染24 h检测以下指标。

1.3.2 miR-196a表达 参照1.2的方法检测两组miR-196a相对表达量。

1.3.3 细胞增殖能力 采用CCK-8法。将两组转染后的细胞按1×104/孔接种于96孔细胞培养板中(100 μL/孔)，分别于转染24、48、72、96 h每孔加入10 μL CCK-8液，37 ℃、5% CO2细胞培养箱中孵育2 h。终止孵育后用酶联免疫检测仪测定各孔450 nm波长处的光密度(OD)值，以OD450表示细胞增殖能力。每孔设置4个复孔及空白对照孔。

1.3.4 细胞凋亡能力 采用流式细胞术。转染48 h取两组细胞，胰酶消化后，PBS冲洗两遍。收集细胞至离心管中，4 ℃条件下1 000 r/min离心5 min，弃上清液，PBS冲洗两遍，加入结合缓冲液，制成密度为1×106/mL的细胞悬液。每组取细胞悬液5 mL于流式管中，依次加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI，混匀后室温下避光染色15 min。上流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.3.5 细胞成瘤能力 采用裸鼠皮下成瘤实验。转染24 h取两组细胞，参照1.3.4的方法制备细胞悬液，调整细胞密度为2×108/mL。取12只裸鼠随机分为miR-196a inhibitor组和inhibitor-NC组，每组6只，分别于右侧后腿皮下注射0.1 mL miR-196a inhibitor和inhibitor-NC细胞悬液。每日观察皮下肿瘤生长情况，每5天测量移植瘤体积(V)，共测量4次。V(mm3)=1/2×L×W2，L为肿瘤长度，W为肿瘤宽度。20天后处死所有裸鼠，取移植瘤，称取移植瘤质量。

1.4 miR-196a对MG-63细胞FOXO1 mRNA及蛋白表达影响的观察

1.4.1 FOXO1 mRNA表达 取1.3.1中转染24 h的两组细胞，参照1.2的方法检测细胞FOXO1 mRNA相对表达量。FOXO1 正向引物： 5′-AACCTGGCATTACAGTTGGCC-3′，反向引物：5′-AAATGCAGGAGGCATGACTACGT-3′，GAPDH 正向引物：5′-GGTGATGCTGGTGCTGAGTA-3′，反向引物：5′-ACTGTGGTCATGAGCCCTTC-3′。以GAPDH作为内参，采用2-ΔΔCt法计算FOXO1 mRNA相对表达量。

1.4.2 FOXO1蛋白表达 采用Western blotting法。取1.3.1中转染24 h的两组细胞，PBS漂洗3次，加入蛋白裂解液提取细胞总蛋白，Bradford法测定蛋白浓度。取30 μg蛋白样品上样，行10% SDS-PAGE，分离蛋白后电转移至PVDF膜，以5% 脱脂奶粉的封闭液室温封闭1 h。分别加入FOXO1(1∶500)一抗和GAPDH一抗 (1∶1 000)，4 ℃孵育过夜，次日洗膜后加入二抗，室温孵育1 h。加入ECL显影液显影后凝胶成像仪曝光拍照，应用Image J软件分析条带灰度值，以FOXO1与GAPDH条带灰度值的比值计算FOXO1蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 两组miR-196a表达比较 miR-196a inhibitor组、inhibitor-NC组miR-196a相对表达量分别为0.31±0.08、1.03±0.03，两组比较P<0.05。

2.2 两组细胞增殖能力比较 见表1。

表1 两组细胞增殖能力比较

注：与inhibitor-NC组同时间点比较，*P<0.05，#P<0.01。

2.3 两组细胞凋亡能力比较 miR-196a inhibitor组、inhibitor-NC组细胞凋亡率分别为(23.50±2.11)%、(3.44±0.39)%，两组比较P<0.01。

2.4 两组成瘤能力比较 miR-196a inhibitor组各时间点移植瘤体积均小于inhibitor-NC组(P均<0.01)，见表2。miR-196a inhibitor组、inhibitor-NC组移植瘤质量分别为(0.50±0.09)、(1.20±0.14)g，两组比较P<0.01。

表2 两组移植瘤体积比较

注：与inhibitor-NC组同时间点比较，#P<0.01。

2.5 两组FOXO1 mRNA和蛋白表达比较 miR-196a inhibitor组、inhibitor-NC组FOXO1 mRNA相对表达量分别为6.14±0.36、1.05±0.06，FOXO1蛋白相对表达量分别为0.53±0.14、0.12±0.06；两组比较P均<0.05。

3 讨论

目前普遍认为，细胞无限增殖和凋亡受阻导致的增殖-凋亡失衡是恶性肿瘤发生、发展的重要机制[8]。基因治疗已成为骨肉瘤治疗研究中的热点，肿瘤基因靶向治疗的基础就是抑制肿瘤细胞增殖、诱导其凋亡。He等[9]发现，miR-34可以通过p53依赖途径抑制CDK4/6、cyclin E2、E2F3/5、cMET、bcl-2表达，诱导细胞周期G1期阻滞，共同调节骨肉瘤细胞的增殖和凋亡。Zhao等[10]报道，下调骨肉瘤细胞中miR-34表达能够通过上调PTEN基因表达，从而抑制肿瘤细胞增殖、促进其凋亡。Thayanithy等[11]证实，miR-382、miR-134、miR-369-3p、miR-544等14q32位点的miRNA在骨肉瘤中表达降低，上调这些miRNA表达可以促进骨肉瘤细胞凋亡。

miR-196a是近期发现的miRNA家族成员之一，从HOX家族基因转录而来。Sun等[12]发现，miR-196a在胃癌组织和细胞系中表达明显升高，并且miR-196a表达与患者的肿瘤大小、临床分期密切相关，miR-196a高表达者预后较差。Liu等[13]报道，miR-196a在非小细胞肺癌组织和细胞系中异常高表达，miR-196a通过下调HOXA5基因表达而促进癌细胞的增殖、侵袭和迁移。但目前有关miR-196a在骨肉瘤中的表达情况及作用机制尚不完全清楚。本研究结果显示，MG-63细胞中miR-196a相对表达量明显高于hFOB1.19细胞，提示miR-196a在骨肉瘤的发生、发展中可能具有癌基因作用。本研究结果显示，下调miR-196a表达的MG-63细胞增殖能力明显降低，细胞凋亡率明显升高，说明抑制miR-196a表达能够抑制骨肉瘤的进展。裸鼠皮下成瘤实验结果显示，降低MG-63细胞中miR-196a表达能够明显降低裸鼠移植瘤的生长速度。

miRNA的作用主要取决于其调控的下游靶基因的生物学效应。FOXO1是FOXO家族的重要成员之一，参与细胞增殖、凋亡和分化等众多重要细胞功能的调控。FOXO1可通过对下游多种靶基因进行表达调控，包括抑制细胞生长、调控细胞周期、促进细胞凋亡、抗过氧化损伤等多重作用，作为肿瘤抑制因子参与到多种肿瘤的形成过程。Yang等[14]发现，肝癌细胞中miR-196a通过靶向调控FOXO1基因的表达调控细胞增殖、凋亡和侵袭。Hou等[15]报道，miR-196a能够通过调控FOXO1基因促进宫颈癌细胞增殖。本研究结果显示，下调MG-63细胞中miR-196a表达后细胞FOXO1 mRNA和蛋白表达均明显升高，提示miR-196a在骨肉瘤发生、发展中的作用可能是通过负向调控FOXO1基因实现的。

综上所述，miR-196a在骨肉瘤细胞中表达升高，下调miR-196a表达能够明显抑制骨肉瘤细胞的增殖及成瘤能力，并促进其凋亡，其机制可能与靶向调控FOXO1基因表达有关。FOXO1有可能成为骨肉瘤基因治疗的潜在靶点。

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