黄志军，王遥，崔国英，高艺璇，王飞，李长忠( 山东省立医院，济南25002；2 邹城市人民医院)

近年来宫颈癌的发病率逐年升高并呈年轻化趋势。人乳头瘤病毒(HPV)感染，特别是高危型HPV持续感染是宫颈癌最重要的致病因素，但其并不是惟一因素。约40%处于性活跃期女性至少感染过一种类型HPV，但仅有不到1%的女性因机体免疫系统无法清除HPV最终发展为宫颈癌。近年研究发现，机体免疫系统可能在其发生、发展过程中具有重要作用[1～5]。人类白细胞抗原(HLA)是人类主要组织相容性复合体(MHC)的编码基因，包括经典的HLA-Ⅰ类分子与非经典的HLA-Ⅰ类分子。HLA是机体免疫系统的重要组成部分，在机体抗原呈递和免疫应答中发挥重要作用。有研究表明，HLA完全缺失、等位基因丢失或基因特异性下调等对肿瘤的发生、发展至关重要[6]。HLA-F属于非经典的HLA-Ⅰ类分子，在乳腺癌、T细胞淋巴瘤等多种肿瘤组织中异常表达[8]。但鲜见其在宫颈癌组织表达的报道。本研究观察了宫颈癌组织HLA-F表达变化，并分析其与患者临床病理参数的关系，探讨HLA-F在宫颈癌发生、发展中的作用。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2012年1月～2016年6月山东省立医院收治的宫颈癌患者115例。纳入标准：①宫颈癌诊断符合《妇产科学》(第7版)中的诊断标准，并经术后组织病理检查明确为宫颈鳞癌或腺癌；②采用广泛性子宫切除+盆腔淋巴结清扫术治疗；③初次治疗，术前未行任何抗肿瘤治疗；④无其他原发恶性肿瘤史或自身免疫性疾病；⑤临床病理资料完整。排除标准：①合并严重的心、肝、肾等重要脏器疾病，以及自身免疫性疾病或其他部位恶性肿瘤者；②临床病理资料不完整者；③术前接受过任何抗肿瘤治疗者。患者年龄23～75(44.53±7.65)岁，其中≤45岁 62例、>45岁 53例；组织学类型：鳞癌87例，腺癌28例；组织分化程度：高中分化29例，低未分化86例；临床分期(参照国际妇产科联盟2009年分期标准)：Ⅰ期76例，Ⅱ期39例；肿瘤直径：≥4 cm 46例，<4 cm 69例；浸润深度：≤1/2肌层45例，>1/2肌层70例；有淋巴结转移30例，无淋巴结转移85例。本研究通过山东省立医院医学伦理委员会批准，患者或其家属均知情同意。

1.2 宫颈癌组织及其配对的癌旁正常组织HLA-F表达检测 采用免疫组化法。取手术切除的宫颈癌组织115例份及其配对的癌旁正常组织20例份，多聚甲醛固定，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，5 μm厚连续切片。将切片置于烤片机上65 ℃烘烤90 min，依次经二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化，蒸馏水冲洗5 min×3次，PBS浸泡5 min；然后置于柠檬酸盐修复液中，采用高压煮沸法进行抗原修复，自然冷却至室温；PBS洗涤5 min×3次，37 ℃ 3% H2O2孵育30 min，灭活内源性过氧物酶；PBS洗涤5 min×3次，滴加兔抗人HLA-F单克隆抗体(1：200)，4 ℃冰箱孵育过夜；次日37 ℃孵育30 min，PBS洗涤5 min×3次，滴加聚合酶辅助剂，37 ℃孵育30 min；PBS洗涤5 min×3次，滴加辣根过氧化物酶标记抗兔IgG聚合物，37 ℃孵育30 min；PBS洗涤5 min×3次，DAB显色，苏木素复染，盐酸乙醇分化，自来水充分冲洗返蓝，梯度乙醇脱水，自然晾干，中性树胶封片，显微镜下观察。以PBS代替一抗作为阴性对照，以HLA-F蛋白阳性表达的脾脏组织作为阳性对照。由两位有经验的病理科医师采用双盲法独立阅片，结果不一致时协商解决。HLA-F阳性染色定位于细胞膜或细胞质，呈棕黄色颗粒状。应用Leica IM50图像采集系统，每张切片随机选取4个200倍视野，采用H-score评分法[9]半定量分析HLA-F表达。H-score评分=∑Pi(I+1)，其中Pi表示染色强度不同的阳性细胞数量占该视野所有细胞总数的百分比，范围为0～100%；I表示染色强度，分为4个评分等级：不着色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。计算每张组织切片所取4个视野的H-score评分，其平均值为该切片最终的H-score评分。以H-score评分表示宫颈组织HLA-F表达。H-score评分越高，说明宫颈组织HLA-F表达越高。

1.3 宫颈癌组织HLA-F蛋白表达与患者临床病理参数关系的分析 比较不同年龄、组织学类型、组织分化程度等临床病理参数的宫颈癌患者H-score评分。

2 结果

2.1 宫颈癌组织与癌旁正常组织HLA-F表达比较 宫颈癌组织HLA-F表达为(2.17±0.83)分，癌旁正常组织为(1.13±0.15)分，二者比较P<0.01。

2.2 宫颈癌组织HLA-F蛋白表达与患者临床病理参数的关系 宫颈癌组织HLA-F表达与患者组织学类型、肿瘤直径以及浸润深度有关(P均<0.05)，与患者年龄、组织分化程度、临床分期及淋巴结转移情况无关(P均>0.05)。见表1。

3 讨论

临床研究发现，宫颈癌患者通常存在免疫系统功能低下，机体抗肿瘤免疫监控失灵可能在其发生、发展过程中发挥重要作用。在机体抗肿瘤免疫中占据主导地位的是细胞免疫，在细胞免疫中参与免疫监视的主要效应细胞有树突状细胞、吞噬细胞、自然杀伤细胞和T淋巴细胞。研究发现，宫颈癌前病变和宫颈癌病灶中树突状细胞数量明显减少、自然杀伤细胞表面的激活性受体表达降低以及辅助性T细胞亚群失衡等[10～12]。提示机体免疫系统功能低下可能与宫颈癌的发生、发展有关。

表1 宫颈癌组织HLA-F表达与患者临床病理参数的关系(分，

HLA-F属于非经典的HLA-Ⅰ类分子，其编码基因位于人类6号染色体短臂上，基因全长5.4 kb，由8个外显子和7个内含子组成。由于成熟HLA-F mRNA缺乏外显子7，其编码的HLA-F蛋白质尾区短于其他HLA-Ⅰ类分子[13]。Geraghty等[13]最早在B淋巴细胞、静止的T细胞和皮肤癌组织内检测到HLA-F的转录产物。Lee等[14]研究发现，尽管在膀胱、皮肤、肝脏等组织细胞内检测到HLA-F表达，但在正常机体中，大多数这类细胞的表面无HLA-F表达。用EB病毒转染的B细胞和单核细胞表面均可检测到HLA-F表达，即静止期的免疫细胞表面缺乏HLA-F表达；而一旦机体免疫细胞被激活，所有胞内表达HLA-F的细胞均能在细胞表面表达[15]。由此推测，HLA-F可作为机体免疫激活的标志物之一。

研究发现，HLA-F的同源性分子HLA-E、HLA-G可参与肿瘤的免疫逃逸[8，16]。但HLA-F参与肿瘤免疫逃逸的相关研究较少。Harada等[17]研究发现，乳腺癌组织HLA-F阳性表达与肿瘤大小有关，但与患者生存率无关。Ishigami等[18]研究发现，胃腺癌组织HLA-F阳性表达与肿瘤浸润深度、淋巴结转移、淋巴管和血管侵犯有关。Zhang等[19]研究发现，胃癌组织HLA-F阳性表达与患者年龄、性别、肿瘤浸润深度以及肿瘤TNM分期均无关。Xu等[20]研究发现，肝癌组织HLA-F阳性表达率明显高于正常肝脏组织，且其表达变化与门静脉癌栓、肿瘤数目及患者性别等有关。以上研究表明，HLA-F在肿瘤中的表达具有组织差异性，在不同肿瘤的发生、发展中可能发挥着不同作用。

Lepin等[21]研究发现，HLA-F四聚体可与免疫抑制性受体ILT-2、ILT-4结合，而淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞等表面均表达ILTs，故HLA-F与ILTs结合可能抑制这些免疫细胞，从而在免疫反应的不同时期产生免疫耐受作用。Goodrige等[22]研究发现，HLA-F分子与HLA-Ⅰ类分子的开放构象可作为配体与自然杀伤细胞及T细胞表面的KIR3DL2结合；而在炎症反应微环境中，KIR3DL2、HLA-F与HLA-Ⅰ表达均上调，提示三者在炎症反应中可能具有免疫调节作用。HLA-F在肿瘤免疫耐受机制中的作用至今尚不清楚，其在宫颈癌致病机制中的作用亦鲜见报道。

本研究结果显示，宫颈癌组织HLA-F表达明显高于癌旁正常组织，与Xu等[20]的研究结果基本一致。本研究结果还发现，HLA-F表达与宫颈癌组织学类型、浸润深度、肿瘤直径有关，而与患者年龄、组织分化程度及淋巴结转移无关，与Harada等[17]报道基本一致。上述结果表明，HLA-F与宫颈癌的发生、发展有关。

综上所述，宫颈癌组织HLA-F表达升高，其表达变化与宫颈癌的发生、发展有关。HLA-F可能通过诱导机体免疫耐受，从而在肿瘤免疫逃逸中发挥重要作用，但其具体机制尚需进一步研究。

参考文献：

[1] Mehta AM, Jordanova ES, Kenter GG, et al. Association of antigen processing machinery and HLA class I defects with clinicopathological outcome in cervical carcinoma[J]. Cancer Immunol Immunother, 2008,57(2):197-206.

[2] 薄艳秋.宫颈癌患者外周血T淋巴细胞及NK细胞检测的临床意义[J].中国继续医学教育，2017，24(9)：50-52.

[3] 杨晶，田威，戚旻.宫颈病变患者HPV感染与淋巴细胞亚群相关细胞因子的关系[J].中国妇幼保健，2017，32(19)：4827-4830.

[4] 余花艳，任统伟.人乳头瘤病毒感染宫颈疾病患者外周血中MDSC、Treg、Th17细胞变化研究[J].中华微生物学和免疫学杂志，2017，37(8)：586-593.

[5] Reiman JM, Kmieciak M, Manjili MH, et al. Tumor immunoediting and immunosculpting pathways to cancer progression[J]. Semin Cancer Biol, 2007,17(4):275-287.

[6] Smyth MJ, Dunn GP, Schreiber RD. Cancer immunosurveillance and immunoediting: the roles of immunity in suppressing tumor development and shaping tumor immunogenicity[J]. Adv Immunol, 2006(90):1-50.

[7] 徐丹萍，林爱芬，颜卫华.HLA-F研究进展[J].生命科学，2012，24(6)：578-82.

[8] Wainwright SD, Biro PA, Holmes CH. HLA-F is a predominantly empty, intracellular TAP-associated MHC class Ib protein with a restricted expression pattern[J]. J Immunol, 2000,164(1):319-328.

[9] 王遥，崔国英，王飞，等.人类白细胞抗原-E在宫颈癌中的表达及意义[J].山东大学学报(医学版)，2016，54(9)：59-63.

[10] Khaiboullina SF， Morzunov SP， Hall MR， et al. Human dendritic cells transfected with a human papilloma virus-18 construct display decreased mobility and upregulated cytokine production [J]. Int J Oncol， 2013，43(5)：1701-1709.

[11] Iijima N, Goodwin EC, Dimaio D, et al. High-risk human papillomavirus E6 inhibits monocyte differentiation to Langerhans cells[J]. Virology, 2013,444(1-2):257-262.

[12] Garcia-Iglesias T, Del Toro-Arreola A, Albarran-Somoza B, et al. Low NKp30, NKp46 and NKG2D expression and reduced cytotoxic activity on NK cells in cervical cancer and precursor lesions[J]. BMC Cancer, 2009(9):186.

[13] Geraghty DE, Wei XH, Orr HT, et al. Human leukocyte antigen F(HLA-F). An expressed HLA gene composed of a class Icoding sequence linked to a novel transcribed repetitive element[J]. J Exp Med, 1990,171(1):1-18.

[14] Lee N, Geraghty DE. HLA-F surface expression on B cell and monocyte cell lines is partially independent from tapasin and completely independent from TAP[J]. J Immunol, 2003,171(10):5264-5271.

[15] Lee N, Ishitani A, Geraghty DE. HLA-F is a surface marker on activated lymphocytes[J]. Eur J Immunol, 2010,40(8):2308-2318.

[16] Rodgers JR, Cook RG. MHC class Ib molecules bridge innate and acquired immunity[J]. Nat Rev Immunol, 2005,5(6):459-471.

[17] Harada A, Ishigami S, Kijima Y, et al. Clinical implication of human leukocyte antigen (HLA)-F expression in breast cancer[J]. Pathol Int, 2015,65(11):569-574.

[18] Ishigami S, Arigami T, Setoyama T, et al. Clinical-pathological implication of human leukocyte antigen-F-positive gastric adenocarcinoma[J]. J Surg Res, 2013,184(2):802-806.

[19] Zhang JG, Zhang X, Lin A, et al. Lesion HLA-F expression is irrelevant to prognosis for patients with gastric cancer[J]. Hum Immunol, 2013,74(7):828-832.

[20] Xu Y, Han H, Zhang F, et al. Lesion human leukocyte antigen-F expression is associated with a poor prognosis in patients with hepatocellular carcinoma[J]. Oncol Lett, 2015,9(1):300-304.

[21] Lepin EJ, Bastin JM, Allan DS, et al. Functional characterization of HLA-F and binding of HLA-F tetramers to ILT2 and ILT4 receptors[J]. Eur J Immunol, 2000,30(12):3552-3561.

[22] Goodridge JP, Burian A, Lee N, et al. HLA-F and MHC class I open conformers are ligands for NK cell Ig-like receptors[J]. J Immunol, 2013,191(7):3553-3562.