陈玉兰 沈宏萍 赵 剑 蒲清荣*

（西南医科大学附属中医医院，四川 泸州 646000）

肾纤康是我院肾病科的临床经验方，已临床应用6年，拟将该经验方开发为医院制剂[1]。该方由黄芪、淫羊藿、西洋参、当归、水蛭等药组成，可补益脾肾、通络消癥。用于各种慢性肾脏疾病，临床疗效显著。为加强医院制剂质量控制，保障临床药物安全、有效，故采用薄层色谱鉴别法对制剂中的黄芪、大黄、当归3味中药材进行定性鉴别，以淫羊藿苷为指标性成分采用高效液相色谱进行含量测定，为该制剂质量标准制定提供依据。

1 仪器与试药

仪器：Agilent Technologies1200高效液相色谱仪；Kromasil 100-5-C18键合硅胶柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；AP-01P真空泵；HH-4数显恒温水浴锅。

试药：黄芪甲苷对照品（批号110781-201314）；大黄酸对照品（批号：0757-200206）；阿魏酸对照品（批号：0773-9910）；淫羊藿苷（110737-200415）；肾纤康颗粒（西南医科大学附属中医医院制剂室，批号170601、170602、170603）

试剂：薄层层析用硅胶G、硅胶H（青岛海洋化工有限公司）；乙腈为色谱纯；水为纯净水；其余试剂均为分析纯。

2 薄层色谱鉴别

2.1 黄芪薄层色谱鉴别：取批号170601样品10 g，研细，加50 mL甲醇回流提取1 h，放冷，过滤，滤液蒸干，残渣加水25 mL使溶解，用水饱和的正丁醇60 mL分2次萃取，合并正丁醇液；用1%的NaOH溶液40 mL分2次洗涤，取正丁醇层挥干，加0.5 mL甲醇使残渣溶解，作为供试品溶液。制备每1 mL甲醇含1 mg的黄芪甲苷对照品溶液[1]。分别吸取对照品溶液2 µL、供试品溶液5 µL，点于硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-水-甲醇（13∶2∶7）下层溶液为展开剂，展开，展距为10 cm，取出晾干，喷10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃烘烤至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，日光下显相同的棕褐色斑点[2-4]。见图1。

2.2 大黄的薄层色谱鉴别：取批号170601样品10 g，研细，加50 mL甲醇超声30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加15 mL水使溶解，再加盐酸1 mL，回流提取30 min，放冷后，用乙醚40 mL分2次振摇提取，合并乙醚液，挥干，加2 mL三氯甲烷使残渣溶解，作供试品溶液。制备每1 mL甲醇含2 mg的大黄酸对照品溶液[1]。分别吸取对照品溶液4 µL，供试品溶液10 µL，点于硅胶H薄层板上，以石油醚（60～90 ℃）-乙酸乙酯-甲酸（7.5∶2.5∶0.6）的上层溶液为展开剂，展开，展距8 cm，取出晾干，置紫外光灯下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的橙黄色荧光斑点[5-6]。见图2。

2.3 当归薄层色谱鉴别：取批号170601样品10 g，研细，加50 mL甲醇超声30 min，过滤，滤液蒸干，残渣用20 mL水溶解，用乙酸乙酯40 mL分2次萃取，取乙酸乙酯液，蒸干，加甲醇1 mL使残渣溶解，作为供试品溶液。制备每1 mL甲醇含0.5 mg的阿魏酸对照品的溶液[1]。分别吸取对照品溶液5 µL，供试品溶液10 µL，点于硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲酸-乙酸乙酯（5∶0.2∶2）为展开剂，展开，展距10 cm，取出晾干，喷10% H2SO4-EtOH，在105 ℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点[7-8]。见图3。

3 含量测定方法与结果

3.1 色谱条件：流动相：乙腈-水（30∶70）；柱温：30 ℃；流速：1 mL/L。

3.2 线性范围的考察

3.2.1 贮备液的制备：精密称取淫羊藿苷对照品适量，加甲醇溶解，摇匀，制得浓度0.216 mg/mL的溶液作对照品贮备液。

表1 加样回收率试验结果

图1 肾纤康颗粒中黄芪的TLC

图2 肾纤康颗粒中大黄的TLC

图3 肾纤康颗粒中当归的TLC

3.2.2 标准曲线：从对照品贮备液中分别精密吸取1、2、3、4、5、7 mL于10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，分别吸取10 μL注入液相色谱仪。以淫羊藿苷溶液的浓度为横坐标（X），其峰面积（Y）为纵坐标绘标准曲线。回归方程：Y=13.712X -32.021，n=6。结果淫羊藿苷在21.6～151.2 μg/mL范围内峰面积与质量呈良好的线性关系，其淫羊藿苷对照品色谱图见图4[9]。

图4 淫羊藿苷对照品色谱图

3.3 供试品溶液制备：精密称定批号170601样品5 g，加入稀乙醇40 mL，称重，超声1 h，再次称重，用稀乙醇补足减少的重量，过滤，取续滤液，用微孔滤膜滤过，即得[10]。

3.4 精密度试验：取浓度0.0432 mg/mL的淫羊藿苷对照品溶液，精密吸取10 μL连续进样5次，记录其峰面值积，结果RSD=0.33%，试验表明该仪器精密度良好。

3.5 稳定性试验：吸取浓度0.0432 mg/mL的淫羊藿苷对照品溶液，精密吸取10 μL，分别于0、2、4、8、12、18 h进样，记录淫羊藿苷峰面积，峰面积的RSD为0.54%，结果表明制备的供试品溶液在18 h内稳定。

3.6 重复性试验：取批号170601样品6份，按3.3项下的方法制备供试品溶液，在上述液相色谱条件下测定溶液中淫羊藿苷的含量，结果该批样品的淫羊藿苷含量平均值0.2992 mg/g，RSD为0.57%。该试验方法重复性较好。供试品色谱图见图5。

3.7 回收率试验：精密称取批号170601样品2.5g，6份，分别精密加入淫羊藿苷对照品溶液（精密称取9.21 mg淫羊藿苷对照品置25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，浓度0.3684 mg/mL）2 mL，其余按3.3项下方法继续制备供试品溶液，在3.1项色谱条件下，进样测定淫羊藿苷面积，计算淫羊藿苷的加样回收率，见表1，表明该方法回收率良好，符合含量测定要求。

图5 供试品色谱图

3.8 样品测定：取批号170601、170602、170603肾纤康颗粒，分别测定，三批样品含量分别为0.292 mg/g、0.303 mg/g、0.295 mg/g。

4 讨 论

4.1 采用薄层色谱法，对黄芪、大黄、当归进行TLC鉴别，色谱斑点清晰，分离效果良好，具有方法简单、快速、重现性好的优点。

4.2 在淫羊藿苷的含量测定中，其在206 nm和270 nm波长处均有吸收峰，但206 nm处杂质吸收峰较多，故选270 nm为检测波长。在流动相的考察中，曾以乙腈-水（26∶74）为流动相，但分离效果不好，又选择乙腈-水（30∶70）为流动相，分离度较好。

[1] 中华人民共和国药典委员会.中国药典[S].化学工业出版社,2015:327.

[2] 陈玉兰,赵剑.蛭龙活血通瘀胶囊的质量标准研究[J].现代生物医学进展,2009,9(21):4113-4115.

[3] 张兰杰,谢程.养血颗粒质量标准研究[J].吉林中医药,2009,29(4):338-340.

[4] 林兵,宋洪涛.参芪补血口服液质量标准的提高[J].中国药师,2016,19(8):1600-1603.

[5] 赵剑,陈玉兰.茵陈四苓颗粒质量标准研究[J].中成药,2014,36(4):763-768.

[6] 蒲清荣,杨思进.神龙贡酒工艺研究[J].云南中医中药杂志,2010,31(11):57-58.

[7] 赵剑,陈玉兰.桂黄降脂颗粒质量标准研究[J].现代生物医学进展,2014,14(15):2952-2955.

[8] 段丽,张永萍.精源胶囊的质量标准研究[J].中国药房,2017,38(9):1231-1233.

[9] 俞吉,朱裕林.高效液相色谱法测定骨疏灵颗粒中淫羊藿苷含量[J].实用药物与临床,2015,18(6):691-693.

[10] 朱丽玲,许汉琳.仙灵骨葆颗粒的薄层鉴别及含量测定[J].湖北中医药大学学报,2014,16(2):43-46.