液氮缓慢冷冻方法对精液冷冻复苏后精子活力的影响

2018-06-13董世桃

中外医学研究 2018年7期

关键词：精液

董世桃

【摘要】目的：研究和分析快速冷冻方法对精液冷冻复苏后精子活力的影响。方法：从2013年7月-2016年7月所有收集到的精液标本中选取其中的150例精液标本作为本次的试验研究对象，将这150例精液标本按照不同的冷冻方法分为观察组和对照组两组，各75例，对照组采用快速冷冻法进行精液冷冻，观察组采用液氮缓慢冷冻法进行冷冻，冷冻时间超过24 h，观察和分析两组精液标本冷冻前后前向运动（PR）精子数量、精子存活率、精子畸形率，对比两组精子冷冻后复苏率和平均精子活力指数。结果：冷冻前，两组精液PR精子数量、精子存活率、精子畸形率、平均精子活力指数比较差异无统计学意义（P>0.05）；冷冻后，快速冷冻方法的精液冷冻复苏后PR精子数量、精子存活率、精子复苏率和平均精子活力指数均显著低于液氮缓慢冷冻复苏后PR精子数量、精子存活率、精子复苏率和平均精子活力指数，差异均有统计学意义（P<0.05）。结论：采用液氮缓慢冷冻法进行精液冷冻会显著提高精液冷冻复苏后的精子前向运动精子数量、精子存活率、精子复苏率和平均精子活力指数，适合在精液冷冻当中应用。

【关键词】精液；精子活力；精子冷冻复苏率；液氮缓慢冷冻方法

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2018.7.078 文献标识码 B 文章编号 1674-6805（2018）07-0162-03

精子冻融技术是人类精子库和辅助生殖技术当中的其中一项核心技术，随着近几年来精子冻融技术的不断发展，精子冷冻的方法越来越多[1]。为了给临床实验提供相关方面的研究依据，本文对液氮缓慢冷冻方法对精液冷冻复苏后精子活力的影响进行简要的探究和分析[2]。具体如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

从2013年7月-2016年7月所有收集到的精液标本中选取其中的150例精液标本作为本次的试验研究对象，这150例精液标本均得到本人的知情同意，这150例捐精志愿者年龄23～36岁，平均（29.37±7.63）岁，这150例捐精者均在取精前禁欲2～7 d，精液量2～5 ml，并且在15 min内将精液完全液化，将这150例精液标本按照不同的冷冻方法分为观察组和对照组两组，各75例。所有精液标本在冷冻前的精子数都≥15×106/ml，正常形态的精子≥4%，前项运动PR精子数≥32%。两组精液标本精液量、冷冻时间、冷冻前精子浓度、冷冻剂的使用、PR精子数和正常形态精子、捐精者年龄等方面比较差异均无统计学意义（P>0.05），可对比。

1.2 冷冻试剂

本次精液冷冻所选的冷冻保护剂是GYC型冷冻保护剂，这种冷冻保护剂的成分包括5%葡萄糖溶液37.4 ml，2.9%枸橼酸钠溶液58.6 ml，甘油56.0 ml，蛋黄48 ml，pH值为7.2的庆大霉素0.5 ml，精液与冷冻剂的比例为3：1[3]。

1.3 方法

1.3.1 精液的冷冻方法按照精液与冷冻剂的比例将加入同一精子冷冻培养基的精液装入冻存管中，并保证培养基和精子细胞能够混合并保持彻底平衡，然后将冻存管卡在金属杆的夹子上，将冻存管分为两组，分别根据快速冷冻法和液氮缓慢冷冻法进行冷冻，其中快速冷冻法是将冻存管直接浸入温度为零下195 ℃的液氮罐当中；液氮缓慢冷冻法是先将冻存管放置到温度为4 ℃的冰箱中，放置时间为5～10 min，将其取出后放置到液氮蒸汽当中熏10 min，然后再从液氮蒸汽中取出冻存管将其浸入到零下196 ℃的液氮罐中[4]。两组精液的冷冻时间要超过24 h。

1.3.2 精子的解冻方法将冻存管从冰箱中取出，并将取出的冻存管从35 ℃的水温中进行水浴，直至冻存管完全溶解。把解冻后精子溶液倒入事先准备好的试管当中，然后缓慢的以一滴一滴的方式將三份精子冲洗培养基和精子溶液进行彻底的混合，确保精子冷冻培养基能够被完全稀释，需要注意的是这一操作要在30 s内完成[5]。然后取300 g精子溶液进行持续10 min离心后，将上面的清水弃除掉后，再加入适量的精子冲洗培养基，直到试管内的精子溶液大约为0.5 ml，进行精子的重悬，然后对精液进行分析，并检测前向运动（PR）精子浓度、精子复苏率和平均精子活力[6]。

1.4 观察指标及评价标准

本次对精液的分析根据《世界卫生组织WHO人类精液检查与处理实验室手册》第五版中的相关规程进行精液的常规分析和精子形态学的分析，观察和分析的内容包括精液量、前向运动（PR）精子浓度、精子复苏率和平均精子活力[7-8]。精子存活率分析方法：将20μl的精液标本和5 g/L的伊红Y溶液按照1：1的比例混合均匀后，覆盖上盖玻片，静置30 s后采用400倍的光学显微镜进行观察，其中活精子不着色，死细胞为红色[9]。精子冷冻复苏率=冷冻后PR精子百分率/冷冻前PR精子百分率。平均精子活力指数=（复苏后的精子活力数/初始精液精子活力数）×100%。

1.5 统计学处理

本文所有数据用 SPSS 13.0 统计软件分析处理，计量资料以（x±s）表示，并采用 t 检验，计数资料以率（%）表示，采用字2检验，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 冷冻前两组精液精子活力情况比较

冷冻前，两组精液PR精子数量、精子存活率、精子畸形率、平均精子活力指数比较差异无统计学意义（P>0.05），见表1。

2.2 冷冻后两组精液精子活力情况比较

冷冻后，快速冷冻方法精液冷冻复苏后PR精子数量、精子存活率、精子复苏率和平均精子活力指数均显著低于液氮缓慢冷冻法精液精子冷冻复苏后PR精子数量、精子存活率、精子复苏率和平均精子活力指数，差异均有统计学意义（P<0.05），见表2。

3 讨论

精液冷冻和辅助生殖技术是不孕不育患者的福音，截至目前，精子庫的建立和供精人工授精已经被广泛应用，使得精子具有长期保存、可以随时取用，同时有效保证了剩余保险等[10]。

虽然近几年来随着医疗技术和医疗卫生事业的不断发展，精液冷冻技术得到快速的发展，已经有越来越多不同的精液冷冻方法，但是对于冷冻前后精液精子的活动力情况，有相关人员和专家对其进行了多方面的实验研究，有大量的实验研究结果和文献资料表明，精液冷冻复苏后的精子活动力就与精液的冷冻方法有一定的关系[11]。

在精子冷冻保存的过程当中，精子不可避免地会受到一些物理和化学效应的影响，精子冷冻的损伤机制中，与精子冷冻时膜流动性和完整性有关，与氧化压力的大小有关，与降温、复苏过程中冰晶形成后的机械损伤有关。有关研究证实，在精子冷冻的过程当中，快速降温会导致精子细胞内形成冰晶，而缓慢冷冻所形成的冰晶在细胞外，两者相比，细胞内冰晶对精子造成的损伤明显高出许多，从这一方面来看，液氮缓慢冷冻法对精液冷冻复苏后精子活动力的影响明显会小很多。

本文对精液液氮缓慢冷冻法冷冻复苏后精子的活动力情况进行了简要的分析和研究，从上述结果中可以看出，液氮缓慢冷冻法冷冻复苏后的精子前向运动（PR）精子数量、精子存活率、精子复苏率和平均精子活力指数等与液氮快速冷冻相比，会显著增强和提高，值得在精液冷冻当中推广应用[12]。

参考文献

[1]刘锋，孟颖，王峰，等.气相冷冻法和液相冷冻法对人类精子运动能力、形态学及超微结构的影响[J].上海交通大学学报：医学版，2012，32（8）：973-978.

[2]孙红勇，顾美娟，孙杨杨，等.冰箱冷冻法和程序降温仪冷冻法对人类精液冷冻复苏后精子参数的影响[J].中华男科学杂志，2014，20（9）：858-860.

[3]张欣宗，熊承良.精子浓度及活力对精子冷冻复苏率的影响[J].中国男科学杂志，2013，27（5）：45-47.

[4]张静静，章志国，贺小进，等.玻璃化冷冻与慢速冷冻对微量精子活动力和DNA完整性的影响[J].安徽医学，2013，34（5）：533-536.

[5]邹沙沙，陈婷婷，王亚楠，等.新型冷冻管承载设计对人类精子复苏率的影响[J].中国男科学杂志，2012，26（7）：19-22.

[6]周梁，张洲，师娟子，等.捐精者精子冷冻复苏率影响因素分析[J].中华男科学杂志，2014，20（6）：523-526.

[7]盛慧强，张欣宗，洪艳.男性肿瘤患者精液冷冻保存后常规参数分析[J].中华男科学杂志，2015，21（1）：44-47.

[8]彭向杰，王斯洋，范立青，朱文兵.精液长时间冷冻储存与冷冻复苏率的相关性研究[J].中国现代医学杂志，2015，25（26）：101-103.

[9]王峰，刘锋，孟颖，李铮.一步熏蒸对麦管冻融人类精子运动能力的影响[J].中华检验医学杂志，2012，35（2）：145-149.

[10]王亚楠，邹沙沙，肖倩，等.冷冻前平衡处理对人精子冻融后相关参数的影响[J].中华男科学杂志，2013，19（10）：886-889.