张月 ，亢泽峰 ，刘健 ，刘彦江

干眼是多种因素、多环节共同参与的病理过程。有研究表明高渗、干燥等环境能激活角结膜上皮丝裂原活化蛋白激酶 （mitogen-activated protein kinase,MAPK）（尤其是 p38/P-JNK）通路，进一步促进多种促炎因子如白细胞介素（IL-1α、IL-1β、IL-6）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosisfactor-α,TNF-α）、基质金属蛋白酶 （matrix metalloproteinases,MMPs）等的分泌，局部炎症反应放大，损害局部角结膜组织及正常的泪液分泌，影响泪液分泌的质和量，引发干眼[1-3]。通过免疫调节和抗炎治疗干眼具有较好的前景。

自拟益气润目汤是以黄芪、当归为主的中药组方。前期临床研究中我们将中国中医科学院眼科医院收治符合干眼诊断标准的113例患者，随机分为治疗组和对照组，治疗组59例（109只眼），对照组54例（104只眼）。治疗组采用益气润目汤内服联合外部熏蒸治疗干眼，对照组采用单纯局部滴用玻璃酸钠滴眼液治疗。根据主观症状和基础泪液分泌试验、泪膜破裂时间、角膜荧光素钠染色等检查进行评分，治疗观察4周。证实益气润目汤内服联合局部熏蒸对干眼具有明显治疗效果，不仅能改善患者眼部不适，且能改变干眼所致的病理改变，能延缓及促进损伤眼表组织的修复。但其机制并不明确，因此结合目前炎症在干眼发病中的作用，本实验试图验证该方是否是通过抑制眼表炎症相关因子的表达，从而达到保护眼表屏障、稳定泪膜、治疗干眼的效果，现将结果报告如下。

1 材料及方法

1.1 主要试剂及材料

SPF级Balb/c健康小鼠，鼠龄6～8周，雌性，体质量18～22 g，购自于北京芳元缘养殖场[SCXK（京）2009-0017]。氯化钠粉剂、0.9%的氯化钠注射液、酚红棉线、5%荧光素钠溶液、Trizol试剂（美国Invitrogen公司）、逆转录试剂盒（美国Invitrogen公司，Lot No-1416528）、Taq 酶（北京 Promega 公司，M166BS）、兔抗多克隆抗体白细胞介素-1β（IL-1β）（武汉博士德生物技术有限公司）、磷酸化氨基末端蛋白激酶（P-JNK）抗体（博奥森 bs-1640R，Lot140224）、聚合辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗兔IgG（武汉博士德生物技术有限公司）、免疫组化检测试剂盒（武汉博士德生物技术有限公司，Lot No-09D04A）、DAB显色试剂盒（武汉博士德生物技术有限公司）、中性树胶（北京优尼康生物科技有限公司）。

1.2 药物

益气润目汤（黄芪36 g、当归10 g、淡竹叶10 g、蝉蜕 6 g、谷精草 10 g、金银花 10 g、山茱萸 18 g、升麻6 g），购自四川新绿色药业科技发展股份有限公司，低、中、高剂量组按人与动物用药换算表配置。玻璃酸钠滴眼液（德国EUSAN GmbH公司，生产批号281053）。高渗盐水配置[5]：用0.9%氯化钠溶液加氯化钠粉剂配制成500 mOsmol/L氯化钠溶液。

1.3 动物造模、分组及给药

依据李晶等[6]使用高渗盐水建立干眼小鼠模型的方法造模。于实验第0天除空白组外，各组均使用高渗盐水点双眼，每日5次（8时、10时、13时、15时、17时），点药14 d。检查小鼠造模后的泪液分泌、角膜荧光素染色情况，以确定是否造模成功。诱导失败者剔除出组，成功诱导的干眼小鼠，采用随机数字表的方法，随机分组，模型组继续点眼14 d，方法同前，维持干眼状态，中药高、中、低剂量组（0.754 g·ml-1，0.377 g·ml-1，0.188 g·mL-1） 给予高渗盐水点眼联合益气润目汤中药颗粒剂灌胃，西药组给予高渗盐水联合玻璃酸钠滴眼液点双眼 （每日4次，1滴/次）干预14 d。空白对照组等量生理盐水灌胃14 d。

1.4 观察IL-1β、P-JNK表达的方法

分别于治疗后第7天、第14天，每组取6只小鼠，处死后将弯镊从外眦部垂直探入，至眼球下方夹住视神经，平行向上提起，摘除眼球，石蜡包埋包括角、结膜组织的完整的眼部组织，切片，备用，行免疫组化，阳性表达情况用Image-proplus 5.1图像分析软件进行免疫组化图像分析，计算IL-1β、P-JNK表达的平均光密度值；同时间点，各组剩余4只小鼠，同上法摘取眼球后，剪除后节部分，保留角膜结膜等眼表组织称重，按照Trizol说明书法提取角结膜组织的RNA，行反转录聚合酶链反应 （reverse tran-scription PCR,RT-PCR）检测眼表组织中IL-1βmRNA的水平。

1.5 统计学方法

应用SPSS17.0统计学软件进行分析。计量资料以表示，采用单因素方差分析比较同一时间点不同组间IL-1β、P-JNK表达的差异，两两比较采用LSD法。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 角膜IL-1β、P-JNK表达的检测

在 400倍光学显微镜下观察，角膜 IL-1β、P-JNK表达成棕黄或黄色，空白对照组见少量表达（图 1，图 2），干眼模型组小鼠的 IL-1β、P-JNK 有显著增高。治疗7d及14d各治疗组IL-1β、P-JNK表达均低于模型组（P＜0.05），中药中剂量组的数值在三个剂量组中最低，与同期西药组有统计学意义的差异（P＜0.05），结果详见表 1、表 2。

表1 各组小鼠治疗后不同时间角膜组织中IL-1β表达的光密度值比较（x¯±s）

表2 各组小鼠治疗后不同时间角膜组织中P-JNK表达的的光密度值比较（x¯±s）

2.2 PCR检测角结膜IL-1βmRNA表达水平

凝胶成像系统下见到目的基因和内参基因条带如图3所示，IL-1βmRNA在各组中均有表达，目的条带IL-1β位于273 bp、管家基因β-actin条带位于364 bp。 治疗 7 d、14 d，各治疗组 IL-1βmRNA 表达水平较干眼模型组明显减少（P＜0.05），但高于空白对照组。结果详见表3。

表3 各组小鼠治疗后不同时间角结膜上皮中IL-1βmRNA的相对表达比较（x¯±s，IL-1β mRNA/β-actin mRNA）

图1 免疫组化检测IL-1β在角膜组织中 的表达（×40）。1A.空白对照组，1B.干眼模型组，1C.益气润目汤中剂量组 IL-1β：白细胞介素-1β 图2 免疫组化检测P-JNK在角膜组织中的表达（×40）。 2A.空白对照组，2B.干眼模型组，2C.益气润目汤中剂量组 P-JNK：磷酸化氨基末端蛋白激酶

图3 各组小鼠治疗后不同时间角结膜组织中β-actin mRNA及IL-1βmRNA表达的电泳图。A.空白对照组，B.干眼模型组，C.益气润目汤高剂量组，D.益气润目汤中剂量组，E.益气润目汤低剂量组，F.玻璃酸钠滴眼液组 IL-1β：白细胞介素-1β

3 讨论

干眼是一种常见的眼表疾病，目前主要采用局部人工泪液替代、抗炎、免疫抑制剂、局部物理疗法及手术治疗等，但远期疗效不理想。中医注重整体观念，采用辨证论治理论，因人因时因地制宜，通过对人体脏腑功能的调节及外邪内热的祛化，不仅能改善临床症状，更能从根本上达到治愈效果。

近些年关于本病的病因及机制研究屡见不鲜，治疗方面也改变了传统的对症治疗，开始重视对病因的把握，注重从发病机制着手寻求更科学的治疗方案。目前众多医家倾向于“炎症是其发病的关键因素[7]，泪膜稳定性下降是其发病的共同通道”这一说法，且此类炎症是非感染性免疫相关炎症。抗炎被纳入干眼治疗规范。近日在美国波士顿召开的美国白内障与屈光手术协会的年会（ASCRS）上，一种名为EBI-005的新型IL-1受体拮抗剂受到参会专家的关注。报告称IL-1在疾病引发的炎症反应中起着关键作用，包括干眼。

部分医家经过观察，发现干眼患者泪液和结膜上 皮 中 的 多 种 细 胞 因 子 包 括 IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α和TGF-β的水平较正常人有显著改变，且与干眼的严重程度相关[7]。IL-1是一种重要的炎症介质，主要有两种前体形式（IL-α 和 IL-β），具有多种生物学功能。IL-1是IL-6和TNF-α等其他炎症因子的强力诱导物，能够通过多种机制扩大固有的免疫应答；同时IL-1与TNF-α能促进金属基质蛋白酶MMPs（MMP-9，MMP-1，MMP-13）在角膜上皮中的表达，通过降解细胞外基质、参与组织重构、解除细胞间的黏附及促进炎症细胞间的迁移而破坏角膜屏障及泪膜的稳定性[8-10]，影响泪液的质、量，促使干眼发生。若能有效抑制炎症因子的表达，在一定程度上就可达到保护眼表屏障（角结膜组织完整），保证泪液的分泌，终止干眼进程的效果。

本研究所用的益气润目汤，主要由黄芪、当归、山茱萸、淡竹叶、金银花、蝉蜕、升麻、谷精草共8味药组成，临床上加减化裁。现代医学研究证实黄芪可明显增强机体非特异性免疫功能，调节细胞免疫和体液免疫，是一种很有活力的双向免疫调节剂，在免疫性疾病的治疗方面有一定效果，既能预防超敏反应性疾病的发生，又可调整自身免疫病患者的免疫应答。能显著下调TNF-α的mRNA基因表达，降低血浆中TNF-α水平，并使超氧化物歧化酶（SOD）合成增多，从而对组织细胞起到保护作用[4]。当归[5]有抗炎、清除氧自由基、保肝利胆、保护肾脏、增强免疫功能等作用。

前期的临床及实验研究证实自拟益气润目汤的疗效[11]，明显提高了泪液的质与量，稳定泪膜，但其机制并不明确，我们采用的高渗盐水诱导干眼模型，操作方便，能保证眼球组织完整的前提下模拟人类干眼的体征及病理改变，从分子基因水平研究益气润目汤可能的机制。

通过本研究表明，正常角结膜组织中炎症相关因子的含量低，当外界环境遭到破坏（干燥、渗透压升高）或角膜屏障失去完整结构，炎症因子效应会逐级增大，扩大局部反应，致使泪膜稳定性下降，发生干眼。本研究PCR及免疫组化结果显示，给予益气润目汤治疗后角结膜组织中炎症相关因子IL-1β、P-JNK表达有明显下降，且中剂量组下降明显优于其他组，说明该方可能通过抑制角结膜组织中的炎性因子表达，减轻局部炎症反应，保护眼表屏障完整，维护泪液分泌的质与量，达到治疗干眼的效果。本研究中的中药制剂是否可以影响眼表细胞的凋亡，各炎症因子之间的关系是否存在协同或对抗，是否对激素、神经传导存在作用等，需要我们进一步研究。

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