宋文 何鲁江

目前，快速检测试剂条一般采用抗原抗体反应的原理来检测目标检测物。但是由于牛奶样本中蛋白质含量较高，容易干扰检测结果，且对于灵敏度要求高，普通的抗体无法达到现场检测灵敏度的要求。胶体金法采用受体结合的原理来检测目标物，由于受体结合的亲和力是抗原抗体结合亲和力的两个数量级以上，因此在牛奶中使用受体结合的原理来制备β-内酰胺高灵敏度检测试剂条成为一个有效的手段。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

阳性奶样、阴性奶样、酪蛋白、Tris、BSA、Borax等化学试剂（采购自Sigma）。镍柱（GE life）、PET-30a质粒（通用生物）、β-内酰胺BSA偶联物（购自杭州隆基生物）。

1.2 仪器与设备

高速冷冻离心机（湘仪）、摇床（湘仪）、蛋白分离柱（Bio-Rad）、分光光度计（新世纪）。

1.3 方法

1.3.1 重组β-内酰胺受体制备

1.3.1.1 单克隆阳性菌体制备

①将合成的质粒冻干粉使用100μL灭菌超纯水稀释。

②吸取稀释后的质粒溶液10μL，加入到100μL的感受態细胞中，冰浴30min。

③完成冰浴后，42℃金属浴热击90s后冰浴2min。

④将制备好的感受态细胞接种于1mL LB液体培养基（加入终浓度万分之一的卡纳抗生素），37℃ 、250rpm培养1h。

⑤培养后的菌体吸取200μL，涂LB固体培养基平板（卡纳抗性），37℃烘箱静止过夜。

⑥挑取菌落生长旺盛，边缘清晰的单菌落，接种于1mL LB液体培养基，37℃ 、250rpm培养过夜。

1.3.1.2 阳性单克隆蛋白表达鉴定

①吸取单克隆菌10μL，加入到10mL LB液体培养基中（2管），37℃、250rpm过夜培养。

②将10mL培养好的菌体加入到250mL LB培养基培养（37℃ 、250rpm），每1h测试菌体浓度，当菌体吸光度超过0.6之后，加入IPTG诱导蛋白表达（4h），其中一管为对照管不进行诱导。……