闻　妹，陈映霞，马兴群，黄　勇，曹梦苒，江　超

过去十年中，血管形成抑制剂已广泛应用于临床，贝伐珠单抗(bevacizumab，BEV)为新型抗血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的人源化单克隆抗体，通过选择性地结合VEGF，阻止VEGF与其受体结合，进而抑制新生血管的形成，达到抑制肿瘤生长的目的。蛋白尿是BEV较常见的不良反应之一，通过抑制血管内皮生长因子信号通路，导致肾功能损伤。这一不良反应目前尚无有效预防及治疗方法，一旦出现3级及3级以上蛋白尿，建议停用血管形成抑制剂，很大程度上降低了其临床治疗效果[1]。多项研究[2-3]证实雷公藤多苷片(Tripterysiumwilfordiipolyglucoside，TWP)可以通过维持肾小球足细胞的功能，降低糖尿病肾病相关蛋白尿。该研究在体外研究的基础上[4]，观测TWP对BEV相关小鼠肾损伤的修复作用并探索讨论其作用机制。

1　材料与方法

1.1材料选用清洁级雄性ICR(institute of cancer research)小鼠30只，由南京军区总院实验动物中心提供。BEV注射液购自瑞士罗氏制药公司；雷公藤多苷片购自上海复旦复华有限公司；cDNA第一链合成试剂盒购自美国 Thermo Fisher (K1622)公司；氯仿(500 ml)、异丙醇(500 ml)购自中国南京化学试剂有限公司；兔抗鼠VEGF单克隆抗体、兔抗鼠nephrin单克隆抗体、兔抗鼠podocin单克隆抗体购自美国Abcam公司。

1.2实验分组30只健康清洁级实验小鼠适应性喂养1周后，随机分为5组： 对照组：尾静脉注射相同体积生理盐水，1次/周，共4周；BEV组：尾静脉注射BEV 60 mg/(kg·周)，共4周；BEV+TWP1组：尾静脉注射BEV 60 mg/(kg·周)，喂服TWP 4 mg/(kg·d)，共4周；BEV+TWP2组：尾静脉注射BEV 60 mg/(kg·周)，喂服TWP 8 mg/(kg·d)，共4周； BEV+TWP3组：尾静脉注射BEV 60 mg/(kg·周)，喂服TWP 16 mg/(kg·d)，共4周；每周称体重调整用药剂量。4周后采集小鼠24 h尿液，测量尿蛋白总量；采集小鼠血液标本，检测血液中血尿素氮(blood ureanitrogen，BUN)、血肌酐(serum creatinine scr，Scr)、谷草转氨酶(glutamic oxalacetic transaminase，AST)、谷丙转氨酶(glutamic-pyruvic transaminase，ALT)等生化指标。最后解剖小鼠，取出肾组织，HE染色方法观察肾小球结构改变，通过电镜观察足细胞超微结构变化，免疫组化方法观测肾组织VEGF、nephrin及podocin蛋白表达变化，Q-PCR方法检测VEGF mRNA、podocin mRNA及nephrin mRNA表达。实验观察过程中，动物自由活动、饮水、进食。

1.3标本收集4周末收集24 h尿液，测尿中蛋白总量，眼球取血，检测血液中Scr、BUN、AST、ALT等指标。解剖小鼠，取出肾组织，行免疫组化及分子检测。

1.424h尿蛋白测定根据试剂盒说明书测定。

1.5血生化指标血清Scr、BUN、AST、AST等生化指标按照试剂说明书在全自动化生化仪上检测。

1.6肾组织的光镜检查取一部分肾组织，大小约0.5 cm，10%福尔马林固定，石蜡包埋，切片厚度2 μm，行HE染色后光镜下观察。

1.7电镜检测足细胞超微结构改变取小于1 mm3肾组织块，用2.5%戊二醛固定，用0.1 mol/L磷酸漂洗液漂洗3次。1%锇酸固定液固定2～3 h，再用0.1 mol/L 磷酸漂洗液漂洗3次；最后经脱水、烘烤、染色后，Hitachi7500透射电镜下观察足突和基膜改变，拍片。

1.8免疫组化法观察肾组织VEGF、nephrin、podocin分布将石蜡切片脱蜡，加入兔抗鼠抗体(VEGF、podocin、nephrin稀释浓度均为1 ∶100)孵育4 ℃过夜，严格按照试剂盒说明操作，切片完成后光镜下观察。

1.9Q-PCR分析VEGF、nephrin、podocinmRNA的表达操作严格按照Q-PCR试剂盒说明书进行，引物均由南京思普金科技有限公司提供。逆转录反应：起始模板RNA 2 ng，反应体系为10 μl，每个检验指标做3个复孔。反应条件为：95 ℃预变性2 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸40 s。引物分别是qmPodocin(123 bp) F:5′-GACCAGAGGAAGGCATCAAGC-3′,R:5′-GCACAACCTTTATGCAGAACCAG-3′;qmVEGF(105 bp) F:5′-CACATAGAGAGAATGAGCTTCC-3′,R:5′-CTCCGCTCTGAACAAGGCT-3′；qmNephrin(87 bp) F:5′-TCTGGGTCCAAACCCTAAGATT-3′,R:5′-TCAATAAGCAGGTGGAACTCAC-3′。

2　结果

2.124h尿蛋白比较BEV组24 h尿蛋白量显著高于对照组；与BEV组比较，BEV+TWP2、BEV-TWP3组24 h尿蛋白量明显降低，差异具有统计学意义(P<0.01)；BEV+TWP1 24 h尿蛋白量差异无统计学意义。见图1。

图1　各组小鼠24 h尿蛋白量的变化

A：对照组；B：BEV 组；C： BEV-TWP1组；D：BEV-TWP2组；E： BEV-TWP3组;与对照组比较：**P<0.01；与BEV组比较：##P<0.01

2.2血生化分析各组小鼠ALT、AST、BUN、CREA差异无统计学意义(P>0.05)(表 1)。

2.3肾组织病理变化光镜下观察对照组小鼠肾组织结构正常；BEV+TWP1、BEV组小鼠肾小球内皮细胞缩小，改变后的结构呈空泡状；与BEV组比较，BEV+TWP2、BEV-TWP3组肾小球结构有明显恢复，见图2。

2.4电镜方法观察肾足细胞超微结构对照组:足细胞形态结构正常；BEV组、BEV-TWP1组：足细胞足突显著减少、广泛融合，微绒毛减少、变短，内皮孔明显增多、扩大、不规则，基底膜局部增厚；BEV-TWP2组、BEV-TWP3组：足细胞足突融合、微绒毛减少、基底膜增厚均明显改善，内皮孔分布正常，BEV-TWP3组小鼠的足细胞接近正常。见图3。

阳极浸在稀硫酸溶液中,电解过程中生成较多H+,H+可透过阳离子交换膜定向迁移到产品室。阴极浸在氢氧化钠溶液中,电解过程中生成较多的OH-,由于阳离子交换膜的限制,只可能是原料室中Na+定向迁移到阴极室,以使阴极室正、负电荷保持平衡。这导致原料室中向产品室定向迁移,必定会跟阳极室迁移过来的H+反应生成次磷酸。强还原性微粒容易在阳极被氧化,若将阳极直接浸入次磷酸溶液中,必定会有次磷酸直接被氧化成亚磷酸、磷酸等,产品就会有多种杂质。

2.5免疫组化检测VEGF、nephrin、podocin蛋白的表达免疫组化结果：对照组、BEV+TWP2、BEV-TWP3组小鼠肾组织VEGF的表达为中、强阳性，BEV组为阴性或弱阳性。见图4～6。

表1　各组小鼠血清生化指标的比较

图2　小鼠肾小球变化　HE×400

图3　各组小鼠电镜下足细胞结构变化

2.6Q-PCR检测小鼠肾组织VEGF、nephrin、podocinmRNA表达VEGF、nephrin、podocin蛋白与mRNA表达量情况，BEV组较对照组明显降低，BEV+TWP2、BEV-TWP3较BEV组显著升高，差异具有统计学意义(P<0.01)；BEV+TWP1组差异无统计学意义。见图7。

3　讨论

BEV在应用4周后其24 h蛋白尿的发生率显著升高。参照相关研究，根据BEV临床使用剂量，在预实验中设计了三组不同的剂量来诱导蛋白尿的产生。结果显示，小鼠被注射BEV 4周后，肾脏出现肾小球内皮细胞萎缩、空泡状改变等病理变化。电镜下显示肾足细胞出现足突明显减少、足突融合增宽、微绒毛稀疏变短、基底膜局部增厚等超微结构改变。这些异常均表明蛋白尿的发生与BEV对足细胞损伤密切相关。且BEV导致的损伤具有剂量相关性。而各组小鼠的Scr、BUN、ALT、AST无显著差异，表明足细胞结构的损伤不至于引起明显的肾功能变化。临床上也显示，蛋白尿的产生并不意味着肾功能会在短期内出现明显变化。

VEGF家族是血小板源生长因子超家族中最重要的成员，肾小球足细胞和肾小管上皮细胞VEGF的表达最显著，VEGF有助于促进血管内皮细胞增殖和新生血管的形成，在维持足细胞功能与基底膜蛋白方面具有重要作用[5-8]。将足细胞VEGF基因敲除，会降低肾小球基底膜重要组成部分、裂隙孔膜相关蛋白nephrin的表达，最终导致蛋白尿的形成[9]。在本实验中，通过免疫组化、Q-PCR显示VEGF蛋白和mRNA表达量与蛋白尿具有相关性。这与之前的研究[10]结果吻合。

图4　各组小鼠足细胞VEGF蛋白表达　免疫组化×400

图5　各组小鼠足细胞nephrin蛋白表达　免疫组化×400

图6　各组小鼠足细胞podocin蛋白表达　免疫组化×400

图7　Q-PCR检测VEGF、nephrin、podocin 基因表达

A:VEGF mRNA；B:nephrin mRNA；C:podocin mRNA；1：对照组；2：BEV 组；3： BEV-TWP1组；4：BEV-TWP2组；5： BEV-TWP3组；与对照组比较：**P<0.01；与BEV组比较：##P<0.01

本实验显示，BEV可降低足细胞VEGF的表达，抑制足细胞相关蛋白nephrin、podocin的表达，进而造成足细胞损伤，最后导致蛋白尿。

TWP具有保护和修复肾小球电荷屏障、抑制免疫应答、改变肾小球机械屏障的损伤等作用，是治疗糖尿病肾病等蛋白尿临床常用药物之一，其疗效和安全性得到大多数学者的认可[11]。本试验证实足细胞损伤是BEV相关蛋白尿主要发生机制之一，nephrin与podocin的表达降低将引起裂孔膜疏松、消失，滤过屏障损坏，从而出现蛋白尿。文献[12]报道TWP具有上调nephrin、podocin表达，改善足细胞损伤的作用。本研究在使用BEV的基础上采用不同剂量的TWP[4、8、16 mg/(kg·d)]干预，结果显示小鼠24 h尿蛋白明显下降。光镜下显示中、高剂量TWP导致的一系列病理改变病变明显缓解，Q-PCR、免疫组化结果显示经过TWP干预的小鼠VEGF、nephrin、podocin表达明显恢复。小鼠足细胞病变改善程度与TWP剂量正相关，主要的机制是TWP通过修复小鼠足细胞损伤，增加肾小球nephrin、podocin表达。

TWP的毒性始终是人们关注的问题，尤其是肝肾功能，本文采用的TWP剂量参考了大量糖尿病肾病的实验研究，证明采用的剂量未引起明显不良反应[13-14]。TWP(20 mg， 口服TID)治疗BEV诱导的蛋白尿个案中，患者服用TWP期间定期检查生化指标，无明显异常，说明TWP是治疗BEV相关蛋白尿的有效药物，有进一步研究的价值。