刘怀东，孙 淼，赵 炜，薛青红，魏春霞，才学鹏，陈 瑞，刘 灿*，孙晓林*

(1. 甘肃农业大学，兰州 730070；2. 中国兽医药品监察所，北京100081；3. 陕西诺威利华生物科技有限公司，陕西杨陵 712100)

猪丁型冠状病毒(Porcine deltacoronavirus, PDCoV)是近年来危害养猪业的重要病毒性腹泻病原，与猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhoea，PED)的发病情况极为类似，临床上较难区分[1]。发病初期仔猪表现为哺乳、吃食后出现呕吐，呕吐物呈黄色或乳白色，并常伴有水样腹泻。发病后期，病猪表现为脱水、行走蹒跚以及精神沉郁等，发病严重者可能死亡[2-4]。

PDCoV属于尼多病毒目内的冠状病毒科，为含有囊膜的单链正义RNA病毒[8]。自2013年以来，在美国、韩国、中国、日本、欧洲等地检测到PDCoV的流行[9-11]。为了进一步探究PDCoV在中国的具体流行情况，对2014-2016年间采集自河北、河南、山东、广东和陕西省的56份粪便和肠组织样本进行了多种腹泻病原检测，对确认为PDCoV阳性的样本进行了病毒分离、全基因序列测定、比对分析与遗传进化分析，以期为该病的防控提供基础支撑。

1 材 料

1.1 样本 腹泻仔猪肠组织与粪便样品来自于2014-2016年间收集的河北、河南、山东、广东与陕西省等地养殖场。

1.2 细胞 ST细胞由陕西诺威利华生物科技有限公司提供。

1.3 主要试剂 病毒DNA/RNA提取试剂盒、反转录酶M-MLV、Ex Taq Premix以及PrimeSTAR Max Premix为宝生物工程(大连)有限公司产品。

2 方 法

2.1 病料前处理与核酸提取 取肠组织与粪便样品少量置于15 mL离心管，添加质量体积比为1∶5的生理盐水，使用匀浆机进行匀浆处理，然后进行3次冻融，之后于4 ℃低温离心机进行12000 r/min离心15 min，取上清液，使用病毒DNA/RNA提取试剂盒，按说明书步骤进行核酸提取。……