何朝辉 唐福才 曹正国 雷鸣 卢泽潮 黄伟娜 雷汉祺

膀胱肿瘤是泌尿系统最常见的恶性肿瘤。膀胱肿瘤中约95%为尿路上皮癌，世界范围内，每年约150 000人死于膀胱癌[1]。在中国，膀胱癌的发病率呈逐渐上升的趋势。目前,膀胱肿瘤的临床治疗以手术为主，但手术后容易复发和转移[2]。影响膀胱癌患者手术疗效和术后复发、转移的最主要原因是肿瘤细胞的侵袭与转移。干细胞蛋白PIWI样蛋白2(piwi-like-2, PIWIL2)是一种新肿瘤-睾丸抗原，在人和鼠，除睾丸组织外其他所有正常组织均不表达PIWIL2蛋白，而在很多肿瘤组织和肿瘤细胞株中PIWIL2蛋白均有表达[3]。PIWIL2可以使抑癌基因/促凋亡基因沉默或降解，激活原癌基因，从而导致或参与各种组织肿瘤的发生[4]。因此，本研究通过检测膀胱尿路上皮癌组织和正常/癌旁组织中PIWIL2的表达差异，对PIWIL2的表达与膀胱尿路上皮癌临床病理的相关性进行了统计学分析，探索PIWIL2在膀胱尿路上皮癌组织中的表达及其临床意义。

材料与方法

一、患者与组织样本

收集2012年1月至2017年10月广州医科大学附属第一医院泌尿外科病理检查证实为膀胱尿路上皮癌患者的手术切除组织，并选择手术切除组织中切片病理检查证实为正常的膀胱尿路上皮组织作为正常/癌旁组织，所有入选膀胱癌患者术前均未行放、化疗或免疫治疗。共收集41例符合标准病例，其中男26例，女15例。临床病理分期按国际抗癌联盟膀胱癌TNM分期标准：Ta期1例、T1期16例、T2期10例、T3期10例、T4期4例；临床分期：非肌层浸润性膀胱癌(Ta～T1)17例、肌层浸润性膀胱癌(T2～T4)24例。低级别膀胱癌11例、高级别膀胱癌30例。

二、研究方法

将临床样本的石蜡包埋组织连续4 μm厚切片，将组织切片贴于载玻片上，载玻片预先泡酸、清洗、干燥，并涂上多聚赖氨酸，经65 ℃恒温烤箱烘干1 h备用。按SP法试剂盒要求进行免疫组化染色。免疫组化结果判断：PIWIL2染色阳性表现为棕黄色或棕褐色。每张切片随机观察具有代表性的10个高倍视野并评分：①胞膜和胞质的染色程度评分标准：基本不着色、着色淡、着色适中、着色深分别为0、1、2、3分；②染色细胞百分率评分标准：着色细胞计数≤5%为0分、6%～25%为1分、26%～50%为2分、>51%为3分；③将每张切片着色程度得分与染色细胞百分率得分相乘为其最后得分，即阳性等级：0～1分为阴性(—)、2～3分为弱阳性(+)、≥4分为强阳性(++)，其中弱阳性和强阳性均属于阳性表达。

三、统计学方法

使用 SPSS 19.0 软件进行统计分析，判断不同年龄、性别、临床分期和病理分级的膀胱癌患者其PIWIL2的表达是否具有统计学差异。计数资料采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、PIWIL2免疫组化结果

免疫组化分析表明，PIWIL2在正常/癌旁组织中呈阴性或弱阳性表达。在膀胱尿路上皮癌组织及正常/癌旁组织中，免疫组化染色阳性表达率分别为75.6%(31/41)、43.6%(22/39)，PIWIL2蛋白在膀胱尿路上皮癌患者癌组织中的表达量明显高于正常组织，两者差异具有统计学意义(P=0.003)。见图1、表1。

A：PIWIL2在正常/癌旁组织中阴性表达；B：PIWIL2在膀胱尿路上皮癌组织中阴性表达；C：PIWIL2在膀胱尿路上皮癌组织中弱阳性表达；D：PIWIL2在膀胱尿路上皮癌组织中强阳性表达

图1 PIWIL2在膀胱尿路上皮癌和正常/癌旁组织中的表达情况(SP染色，×200)

表1 PIWIL2在膀胱尿路上皮癌组织及正常膀胱/癌旁组织中的表达

二、PIWIL2的表达与患者临床一般资料相关性分析

将免疫组化结果与膀胱尿路上皮癌患者的年龄、性别、临床分期及分化程度进行χ2检验分析，结果显示，PIWIL2在膀胱尿路上皮癌组织中的表达与膀胱尿路上皮癌的临床分期相关(P=0.035)，而与年龄、性别和分化程度无统计学相关(P>0.05)。见表2。

表2 PIWIL2的表达与患者临床一般资料的相关性

讨 论

癌症是目前引起人类死亡的主要原因之一，发达国家癌症是居民死亡的首要原因，发展中国家癌症位居死因第二位。世界范围内，膀胱癌发病率居恶性肿瘤的第九位，男性排名第六位，女性排名在第十位之后[5]。2015 年中国膀胱癌新发病例约80 500例，其中男性约62 100例，女性18 400余例，男性患者膀胱癌的发病率已超过前列腺癌，居男性泌尿系统恶性肿瘤之首[6]。膀胱尿路上皮癌占膀胱癌的95%以上，目前临床上以手术治疗为主，但术后容易复发和转移[2]。鉴于其高发生率和复发率，膀胱癌一直是肿瘤分子生物学研究的重点。但是，膀胱癌发生的机制目前尚不完全清楚，对其高发生率、易复发和转移的基础尚缺乏了解。因此，对膀胱癌的发生机制及致病因子在其发生、发展和转移过程中的调控机制进行研究是当前学者十分关注的课题。干细胞蛋白PIWIL2属于Argonaute蛋白家族。PIWIL2是Argonaute蛋白羧基端的一个保守区域，与氨基端另外一个保守区PAZ及中间区域共同组成复合物RISC[7]。Taubert等[8]研究表明，PIWIL 2在膀胱尿路上皮癌的生物学行为中发挥作用，并且有可能被用作高风险膀胱癌患者的预后指标。

本研究利用免疫组化检测膀胱癌组织和正常膀胱组织中PIWIL2的表达差异，结果发现PIWIL2蛋白在膀胱癌组织中的表达明显高于正常组织，并且差异具有统计学意义(P=0.003),提示与正常膀胱组织相比，膀胱尿路上皮癌中的PIWIL2存在过表达。再结合免疫组化评分，分析PIWIL2表达与膀胱癌患者年龄、性别、临床分期和分化程度的关系。结果表明，PIWIL2在膀胱尿路上皮癌患者组织中过表达，与年龄、性别和分化程度无相关性(P>0.05), 但与膀胱尿路上皮癌的临床分期明显相关(P=0.035)，提示PIWIL2的高表达与膀胱尿路上皮癌的恶性程度有明显相关性，揭示PIWIL2对膀胱尿路上皮癌的诊断和恶性程度的判断具有一定的指导意义。

综上所述，PIWIL2在膀胱尿路上皮癌中高表达，且与膀胱尿路上皮癌的临床分期密切相关，可作为膀胱尿路上皮癌的诊断及其临床分期的观察指标，但PIWIL2在膀胱尿路上皮癌中的具体机制尚不明确，需要结合分子生物学和细胞生物学技术，进一步研究PIWIL2在膀胱尿路上皮癌发生发展中的作用及其分子机制，为PIWIL2应用于膀胱尿路上皮癌的诊治和预后监测提供更加充分的实验依据。

[1] Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive molecular characterization of urothelial bladder carcinoma[J]. Nature,2014,507(7492):315-322.

[2] Burger M, Catto JW, Dalbagni G, et al. Epidemiology and risk factors of urothelial bladder cancer[J]. Eur Urol,2013,63(2):234-241.

[3] Seto AG, Kingston RE, Lau NC. The coming of age for Piwi proteins[J]. Mol Cell,2007,26(5):603-609.

[4] Lee JH, Schutte D, Wulf G, et al. Stem-cell protein Piwil2 is widely expressed in tumors and inhibits apoptosis through activation of Stat3/Bcl-XL pathway[J]. Human Mol Genet,2006,15(2):201-211.

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[6] Chen W, Zheng R, Baade PD, et al. Cancer statistics in China, 2015[J]. CA Cancer J Clin,2016,66(2):115-132.

[7] Song JJ, Smith SK, Hannon GJ, et al. Crystal structure of Argonaute and its implications for RISC slicer activity[J]. Science,2004,305(5689):1434-1437.

[8] Taubert H, Wach S, Jung R, et al. Piwil 2 expression is correlated with disease-specific and progression-free survival of chemotherapy-treated bladder cancer patients[J]. Mol Med,2015,21:371-380.