邵金曼，刘妍，陈容娟，周怡，赵丽，刘佳梁，李乐，许智慧，徐东平

乙型肝炎病毒(HBV)感染严重危害人类健康，持续病毒复制增加了肝硬化和肝癌的发生风险，而抗HBV治疗是限制或逆转疾病进展的关键[1]。核苷(酸)类似物(NAs)是临床上最常用的抗HBV药物，分为核苷类似物和核苷酸类似物，前者包括拉米夫定(LAM)、替比夫定(LdT)、恩替卡韦(ETV)和恩曲他滨，后者包括阿德福韦酯(ADV)和替诺福韦酯(TDF)。NAs因能有效抑制病毒复制、口服方便、价格低廉而在临床广泛应用[2]，但长期服用产生的耐药性可导致治疗失败，是困扰临床的难题[3]。在近20年的临床实践中，我国已积累了相当数量的NAs治疗失败并检出各种耐药突变的患者。在2014年TDF被我国批准用于慢性乙型肝炎(CHB)抗病毒治疗之前，ETV耐药患者的挽救治疗方案以ETV+ADV为主，但长期应用仍有患者应答不佳，此类患者临床上换用TDF或TDF+ETV挽救治疗的病毒学动态演变特点少见报道。本研究的目的是分析临床上NAs治疗失败并检出ETV耐药突变的HBV感染患者ETV+ADV联合挽救治疗应答不佳、继续TDF±ETV挽救治疗期间的临床疗效与病毒学动态演变特点，为临床实践提供帮助。

1 资料与方法

1.1 研究对象 2003年7月－2006年12月就诊于解放军302医院的4例NAs治疗失败并检出ETV耐药突变的CHB患者，在接受ETV(0.5mg/d)+ADV(10mg/d)联合挽救治疗后仍应答不佳。4例患者无其他病毒合并感染和其他原因引起的肝病，在接受ETV+ADV联合治疗应答不佳后以TDF(300mg/d)或TDF(300mg/d)+ETV(0.5mg/d)继续联合挽救治疗，并随访观察至2016或2017年。本研究经解放军302医院伦理委员会批准，患者均知情同意。

1.2 主要试剂 病毒DNA-OUT提取试剂盒购自北京天恩泽公司；2×EasyTaq PCR SuperMix及Trans109感受态细胞均购自北京全式金公司；胶回收试剂盒购自德国Qiagen公司；pGEM-Teasy载体购自美国Promega公司；T4DNA连接酶购自日本TaKaRa公司。引物合成和基因测序由北京天一辉远公司完成。

1.3 方法

1.3.1 临床和实验室检查 收集每例患者接受ETV+ADV及换成TDF或TDF+ETV前后的临床和实验室数据，包括人口统计资料、NAs治疗史及治疗时间、HBV抗原抗体等血清学指标、血清HBV DNA水平、血生化指标包括丙氨酸转氨酶(ALT)、血清肌酐(Cre)和血磷(P)水平等。

1.3.2 HBV RT区基因突变分析与基因型分析 使用病毒DNA提取试剂提取患者血清HBV DNA，采用本课题组创新建立的超灵敏巢式PCR方法扩增HBV RT基因(国家发明专利ZL200910092331.1)[4]。对PCR产物进行DNA双向测序，对rt80、rt173、rt180、rt181、rt184、rt202、rt204、rt214、rt236和rt250等经典和潜在的LAM、ADV、ETV耐药相关位点的序列峰图进行分析。按照文献[5]中的方法进行HBV基因分型。

1.3.3 基因克隆 将PCR产物直接克隆至pGEMTeasy载体，随机挑选20个克隆进行DNA序列测定并分析耐药相关变异。

2 结 果

2.1 患者在挽救治疗期间耐药突变病毒的动态演变特点 4例患者均为男性，年龄44～56岁，平均49.5岁。其中3例患者(P2，P3，P4)HBeAg阳性，2例患者(P1，P4)ALT水平异常(表1)。

4例患者在ETV+ADV治疗之前有至少1种NAs治疗失败史，继而接受ETV+ADV联合挽救治疗。在ETV+ADV治疗开始时HBV RT区基因突变分析显示4例患者均检出ETV耐药变异位点(rtM204I/V且同时出现rtT184/rtS202/rtM250这3个位点之一的突变)。HBV RT区基因型分析显示所有患者均为C基因型(表1)。为了观察ETV+ADV联合治疗开始时HBV病毒株的动态演变特点，用课题组建立的超灵敏方法(检测限为20IU/ml，下同)对4例患者不同时间点的血清样本进行基因克隆(≥20个/样本)分析，结果显示P1在ETV+ADV治疗开始时克隆结果为rtL180M+rtT184L+rtM204V占100%，均为ETV耐药株；P2在ETV+ADV治疗开始时克隆结果为rtL180M+rtT184A+rtM204V占80%和rtL180M+rtT184A+rtM204V+rtV214A占20%，均为ETV耐药株；P3在ETV+ADV治疗开始时克隆结果为rtV173L+rtL180M+rtM204I+rtM250L占100%，均为ETV耐药株；P4在ETV+ADV治疗开始时克隆结果为rtL180M+rtT184L+rtM204V占94.4%和WT占5.6%，以ETV耐药株为主(图1)。

4例患者均接受了40.5(14～63)个月的ETV+ADV联合治疗。ETV+ADV联合治疗后HBV RT区基因突变分析显示3例患者有ETV耐药变异位点，此外1例患者无耐药变异位点，并且除了HBV经典耐药变异位点还有潜在耐药变异位点rtV214A。为了观察ETV+ADV联合治疗后HBV病毒株的动态演变特点，对4例患者不同时间点的血清样本进行基因克隆(≥20个/样本)分析，结果显示P1在应用ETV+ADV治疗47个月后克隆结果为rtL180M+rtT184L+rtM204V占75%和rtA181S+rtT184L+rtM204I占25%，均为ETV耐药株；P2在应用ETV+ADV治疗14个月克隆结果为rtL180M+rtT184A+rtM204V+rtV214A占57%和rtL180M+rtT184A+rtM204V占43%，均为ETV耐药株；P3在应用ETV+ADV治疗51个月后克隆结果为WT占79%、rtM250L占11%、rtV173L+rtL180M占5%和rtV173L+rtL180M+rtM204I占5%，以WT为主；P4在应用ETV+ADV治疗26个月克隆结果均为WT(图1)。

表1 ETV+ADV联合治疗前患者基线特征和基因突变形式Tab.1 Baseline characteristics and genotypic mutation patterns of patients prior to combined ETV+ADV therapy (direct PCR sequencing)

图1 4例患者抗病毒治疗期间的临床特征及HBV耐药株进化特点Fig.1 Evolution of resistant HBV strains with clinical virology and biochemical response features in 4 cases during antiviral treatment

4例患者在接受了40.5(14～63)个月的ETV+ADV联合治疗后继续换用TDF或TDF+ETV治疗32.5(23～40)个月，HBV RT区基因突变分析显示1例患者有ETV耐药变异位点，2例患者无耐药变异位点，此外，1例患者HBV DNA巢式PCR未检测出。为了观察TDF或TDF+ETV治疗后HBV病毒株的动态演变特点，对4例患者不同时间点的血清样本进行基因克隆(≥20个/样本)分析，结果显示P1在应用TDF治疗23个月后克隆结果全部为WT；P2应用TDF+ETV治疗38个月后克隆结果为rtL180M+rtT184A+rtM204V占75%和rtL180M+rtT184A+rtM204V+rtV214A占 25%，均为ETV耐药株；P3在应用TDF治疗40个月后克隆结果全部为WT；P4在应用TDF治疗17个月后HBV DNA巢式PCR未检测出(图1)。

2.2 患者在挽救治疗期间的病毒学、生化学和血清学应答 NAs用药过程中的HBV DNA和ALT变化见图1。4例患者在ETV+ADV联合治疗前血清HBV DNA为4.28(2.93～7.45)log10IU/ml，在接受了40.5(14～63)个月的ETV＋ADV联合治疗后HBV DNA下降到2.99(2.36～5.93)log10IU/ml，均未实现血清HBV DNA检测不到。在ETV+ADV挽救治疗期间，P1在治疗4个月后ALT水平恢复正常，P4在治疗7个月后ALT水平恢复正常，3例患者均未实现HBeAg血清学转换，4例患者均未实现HBsAg阴转。随后4例患者换用TDF或TDF+ETV继续挽救治疗32.5(23～40)个月，P1和P3均在3个月后、P2和P4分别在28和17个月后血清HBV DNA检测不到(血清HBV DNA ＜40IU/ml)，随访15(10～37)个月血清HBV DNA持续检测不到。4例患者在TDF或TDF+ETV继续挽救治疗期间，ALT波动并维持正常水平，3例患者均未实现HBeAg血清学转换，4例患者均未实现HBsAg阴转(表2)。

表2 TDF挽救治疗期间4例患者的病毒学、生化学和血清学应答Tab.2 Virological, biochemical and serological responses of 4 patients during TDF rescue treatment

2.3 患者在挽救治疗期间的不良反应 4例患者在TDF或TDF+ETV挽救治疗10(3～28)个月后血清HBV DNA检测不到，并在后续随访的15(10～37)个月仍维持此水平，ALT水平为15～67U/L，最终均恢复正常(＜40U/L)，均未出现病毒学突破(HBV DNA水平比治疗中最低点上升1个log值，或一度转阴后又转为阳性)和ALT水平巨大波动(＞2×40U/L)。4例患者随访期间血清Cre维持在正常范围内(62～115μmol/L)，P2在随访第9个月时血磷水平下降，但未出现与之相关的临床症状如骨密度减少和骨软化症等，在未改变TDF用量的情况下随访至38个月血磷水平恢复正常，其余3例患者随访期间血磷水平均维持正常(0.9～1.34mmol/L)，未出现与ADV、ETV或TDF相关的不良事件。

3 讨 论

多项研究显示，ETV+ADV对NAs治疗失败的ETV耐受患者具有良好的抗病毒活性[6-8]，但临床上仍出现了许多ETV+ADV应答不佳的患者。对ETV+ADV治疗失败的ETV耐药患者的挽救治疗选择是困扰临床的棘手问题。本研究分析了真实临床实践中4例NAs治疗失败并检出ETV耐药突变的HBV感染患者先后经历ETV+ADV联合挽救治疗应答不佳、TDF±ETV继续挽救治疗期间的病毒学演变及临床疗效。4例患者在挽救治疗前均检出ETV耐药变异位点，这些耐药变异株可能与患者对ETV+ADV应答不佳有关[9]。此外，患者对ETV+ADV应答不佳也可能与ADV抗病毒活性低和其用药剂量低(10mg/d)有关[10]。ADV的抗病毒活性与病毒载量有关，当病毒载量很高时，更容易出现ADV应答不佳[11]。本研究的4例患者中有3例在接受ETV+ADV治疗前HBV DNA＞3.0log10IU/ml，其中1例患者HBV DNA＞7.0log10IU/ml，因此更易出现ADV应答不佳。此外，分析发现RT区新型ADV耐药变异rtA181S[12]以及潜在ADV耐药变异rtV214A[13]的存在也可能是患者对ETV+ADV应答不佳的原因之一。

有多项研究显示TDF或TDF+ETV对多种NAs治疗失败的患者具有很好的疗效[14-17]，但挽救治疗期间病毒学动态演变的分析少见报道。本研究证实了ETV+ADV挽救治疗应答不佳的ETV耐药患者以TDF±ETV继续挽救治疗可获得很好的疗效，结合动态克隆演变分析发现，即使临床挽救治疗达到血清HBV DNA检测不到，仍有可能存在低水平病毒复制。进一步分析发现，TDF±ETV挽救治疗后实现完全病毒学应答的快慢可能与病毒株是否持续存在有关。Lim等[18]报道了90例ETV耐药患者，换用TDF或TDF+ETV治疗11个月后85.6%的患者实现了血清HBV DNA检测不到，仅有少数患者仍有前期存在的耐药突变形式，与本研究结果相一致，说明ETV耐药株的消失可能与患者快速实现完全病毒学应答有关。而Gwak等[19]报道了90例ETV耐药患者分别换用TDF或TDF+ETV治疗，33个月后仍有6例患者HBV DNA＞60IU/ml，且其中2例仍可检出前期存在的耐药突变形式。本研究中P2在接受28个月的TDF+ETV治疗后才实现HBV DNA检测不到，克隆分析显示仍存在ETV耐药突变株，这种慢速实现完全病毒学应答可能是导致TDF+ETV治疗后ETV耐药病毒持续存在的原因。

研究显示，TDF治疗经治患者有较低的HBeAg血清学转换率和HBsAg阴转率[20-21]，与本研究结果相一致。此外，低血清学转换率也可能与基因型有关，与其他基因型相比，C基因型获得血清学转换的概率更低，而本研究纳入的4例患者均为C基因型[22]。

TDF与ADV类似，均经肾脏排泄，对肾脏功能损伤的病例也频见报道。TDF相关性肾损伤包括肾小管功能障碍、间质性肾炎、急性肾小管坏死、范可尼综合征等[23]。因此ADV经治患者换用TDF是否会引起或加重肾损害也引起了临床关注。多项研究表明，无论是TDF初治还是ADV经治换用TDF均有良好的安全性和耐受性[24-26]。本研究4例患者也未出现与TDF相关的不良事件。

本研究虽然样本量较少，但均是发生了ETV耐药且对以往常用ETV+ADV挽救治疗效果不佳的患者，随访治疗时间长达11.09(9.33～13.08)年。本研究证实了ETV+ADV挽救治疗应答不佳的ETV耐药患者以TDF±ETV继续挽救治疗可获得良好疗效，并发现ETV耐药株检测不到可能与患者实现病毒学应答的快慢以及早期演变为野生病毒有关，但即使临床治疗达到血清HBV DNA检测不到，仍有可能存在低水平病毒复制，提示对此类患者需长期应用TDF±ETV抗病毒治疗。

[1]Lim YS. Management of antiviral resistance in chronic hepatitis B[J]. Gut Liver, 2017, 11(2): 189-195.

[2]Zhang W, Xu RF, Tian RF, et al. Influence of adefovir dipivoxil versus telbivudine combined with entecavir on liver function and serum virology in hepatitis B patients with decompensated liver cirrhosis[J]. Med J Chin PLA, 2016, 41(12): 1041-1044. [张伟,许荣放, 田锐锋, 等. 阿德福韦酯与替比夫定联合恩替卡韦对失代偿期乙肝肝硬化患者肝功能及血清病毒学指标的影响[J]. 解放军医学杂志, 2016, 41(12): 1041-1044.]

[3]Xu DP, Liu Y. A novel insight of understanding of mechanism of hepatitis B virus drug resistance by combining genotype resistant mutation detection and phenotype resistance analysis[J]. Med J Chin PLA, 2012, 37(6): 535-538. [徐东平, 刘妍. 结合基因型耐药突变检测与表型耐药分析探索乙肝病毒耐药的新认识[J]. 解放军医学杂志, 2012, 37(6): 535-538.]

[4]Xu DP, Liu Y, Cheng J, et al. Multiple-site analysis of HBV drug resistant mutations in 340 patients with chronic hepatitis B[J].Chin J Hepatol, 2008, 16(10): 735-738. [徐东平, 刘妍, 成军,等. 340例慢性乙型肝炎患者乙型肝炎病毒多位点耐药相关突变分析[J]. 中华肝脏病杂志, 2008, 16(10): 735-738.]

[5]Liu Y, Zhong Y, Zou Z, et al. Features and clinical implications of hepatitis B virus genotypes and mutations in basal core promoter/precore region in 507 chinese patients with acute and chronic hepatitis B[J]. J Clin Virol, 2010, 47(3): 243-247.

[6]Kim HS, Yim HJ, Jang MK, et al. Management of entecavirresistant chronic hepatitis B with adefovir-based combination therapies[J]. World J Gastroenterol, 2015, 21(38): 10874-10882.

[7]Xu XH, Li GL, Qin Y, et al. Entecavir plus adefovir rescue therapy for chronic hepatitis B patients after multiple treatment failures in real-life practice[J]. Virol J, 2013, 10: 162.

[8]Chae HB, Kim MJ, Seo EG, et al. High efficacy of adefovir and entecavir combination therapy in patients with nucleosiderefractory hepatitis B[J]. Korean J Hepatol, 2012, 18(1): 75-83.

[9]Kim SS, Cheong JY, Lee D, et al. Adefovir-based combination therapy with entecavir or lamivudine for patients with entecavirrefractory chronic hepatitis B[J]. J Med Virol, 2012, 84(1):18-25.

[10]Gallego A, Sheldon J, García-Samaniego J, et al. Evaluation of initial virological response to adefovir and development of adefovir-resistant mutations in patients with chronic hepatitis B[J]. J Viral Hepat, 2008, 15(5): 392-398.

[11]Sinn DH, Lee H, Gwak GY, et al. Virological response to adefovir monotherapy and the risk of adefovir resistance[J]. World J Gastroenterol, 2011, 17(30): 3526-3530.

[12]Liu Y, Li X, Xin S, et al. The rtA181S mutation of hepatitis B virus primarily confers resistance to adefovir dipivoxil[J]. J Viral Hepat, 2015, 22(3): 328-334.

[13]Locarnini S, Mason WS. Cellular and virological mechanisms of HBV drug resistance[J]. J Hepatol, 2006, 44(2): 422-431.

[14]Zhang Q, Han T, Nie CY, et al. Tenofovir rescue regimen following prior suboptimal response to entecavir and adefovir combination therapy in chronic hepatitis B patients exposed to multiple treatment failures[J]. J Med Virol, 2015, 87(6): 1013-1021.

[15]Kim JH, Ahn SH, Ko SY, et al. The efficacy of tenofovir-based therapy in patients showing suboptimal response to entecaviradefovir combination therapy[J]. Clin Mol Hepatol, 2016,22(2): 241-249.

[16]Liu Y, Zhang Y, Yuan J, et al. Efficacy of tenofovir disoproxil fumarate therapy in Chinese chronic hepatitis B patients after multiple antiviral failures[J]. Hepatol Res, 2015, 45(10):E43-E52.

[17]Park JY, Kim CW, Bae SH, et al. Entecavir plus tenofovir combination therapy in patients with multidrug-resistant chronic hepatitis B: results of a multicentre, prospective study[J]. Liver Int, 2016, 36(8): 1108-1115.

[18]Lim YS, Byun KS, Yoo BC, et al. Tenofovir monotherapy versus tenofovir and entecavir combination therapy in patients with entecavir-resistant chronic hepatitis B with multiple drug failure:Results of a randomised trial[J]. Gut, 2016, 65(5): 852-860.

[19]Gwak GY, Lim YS, Byun KS, et al. Three-year efficacy and safety of tenofovir disoproxil fumarate monotherapy for entecavirresistant chronic hepatitis B[J]. Hepatol Int, 2017, 11(1): S6.

[20]Suzuki F, Suzuki Y, Hosaka T, et al. Efficacy of long-term tenofovir-based rescue therapy in patients with chronic hepatitis B refractory to nucleoside/nucleotide analogs[J]. J Gastroenterol, 2017, 52(5): 641-651.

[21]Lo AO, Wong VW, Wong GL, et al. Efficacy of tenofovir switch therapy for nucleos(t)ide-experienced patients with chronic hepatitis B[J]. Aliment Pharmacol Ther, 2015, 41(11): 1190-1199.

[22]Shi YH. Correlation between hepatitis B virus genotypes and clinical outcomes[J]. Jpn J Infect Dis, 2012, 65(6): 476-482.

[23]Perazella MA. Tenofovir-induced kidney disease: An acquired renal tubular mitochondriopathy[J]. Kidney Int, 2010, 78(11):1060-1063.

[24]Manns M, Heathcote J, Marcellin P, et al. 1017 efficacy of tenofovir df treatment in patients with a suboptimal response to adefovir dipivoxil[J]. J Hepatol, 2010, 52(10): S393.

[25]Hou J, Gao Z, Xie Q, et al. 144 weeks tenofovir disoproxil fumarate monotherapy or switching from adefovir dipivoxil after 48 weeks results in potent viral suppression and a favorable safety profile in chinese patients with chronic hepatitis B[J].Hepatol Int, 2015, 9: S30-S31.

[26]Lampertico P, Mangia G, Viganò M, et al. Tenofovir monotherapy is effective for adefovir experienced patients but requires careful monitoring of glomerular and tubular function and proactive dose reductions: A 4-year study in 320 patients[J].Hepatology, 2013, 58(4): 649A-650A.