梁成宵，古瑞，李婷，杨冠，吴东叶，屈琳林，李凤君，田伏洲，孙红玉

终末期肝病包括急性肝衰竭、肝硬化和肝癌等，病情凶险、病死率高，严重危害着人们的身体健康。肝移植是目前治疗终末期肝病唯一有效的方法，但供体器官短缺、免疫抑制以及继发感染等问题限制了其在临床的应用[1-2]。近年来，随着再生医学的不断进步，干细胞移植技术在各种终末期肝病的治疗中取得了令人鼓舞的进展[3-4]，但研究显示其疗效欠佳，这是由于肝脏病变部位处于相对恶劣的微环境，如缺血性缺氧、炎症反应和氧化应激等，均会影响干细胞的黏附与存活[5]。因此，临床上亟待寻找新的策略来提高干细胞修复肝病的疗效。

可注射水凝胶作为一种新颖的工具，可用于干细胞或药物递送，受到再生医学研究者的极大关注[6]。可注射性水凝胶种类繁多，常见的有胶原、MatrigelTM、壳聚糖、纤维蛋白等。最近有研究表明，基于天然细胞外基质(extracellular matrix，ECM)材料的组织工程研究有望为组织损伤修复提供一种新的策略[7-9]。ECM脱细胞支架材料是指通过物理、化学和生物学方法将器官组织的细胞成分全部清除，从而完整地保留血管系统、超微结构以及主要细胞外基质成分[10]，能够提供最天然的细胞外微环境，已成为组织再生领域有应用前景的支架材料。特别是ECM水凝胶材料，可通过微创注射的方法将材料或细胞递送到组织损伤部位，具有微创、安全、可控性强等优点，大大增强了脱细胞基质材料在临床上的应用[11-12]。国际上已将ECM水凝胶应用于心脏、软骨和皮肤的组织再生领域，研究表明其对组织的修复与重建均发挥了有益作用[13-17]。然而，针对肝脏ECM水凝胶材料的研究相对较少，特别是尚未见有关其生物相容性的报道。基于此，本研究在制备肝脏脱细胞基质的基础上，研制与表征肝脏相似的ECM水凝胶材料，并系统评价其对BRL-3A 的细胞活力、增殖情况及黏附作用的影响，以期为后续肝脏ECM水凝胶的体内应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及主要试剂 健康成年雄性SD大鼠(体重200～220g)购自成都达硕实验动物有限公司；大鼠正常肝细胞系BRL-3A 细胞购自中国科学院细胞库。十二烷基磺酸钠(sodium dedecyl sulfate，SDS；美国Amresco)，聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100，美国Sigma)、异硫氰酸荧光素标记的鬼笔环肽(FITC-Phalloidin，美国Sigma)、4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，美国Sigma)，胃蛋白酶、DMEM培养基、胎牛血清(美国Gibeo)，HE(北京索莱宝科技有限公司)，AlamarBlue试剂、Live/Dead活性/细胞毒性试剂盒(美国Thermo)。

1.2 主要仪器 扫描电镜(日本，日本电子)，倒置相差荧光显微镜 (日本Olympus，IX81)，CO2培养箱、离心机(美国Thermo)，分光光度计(屹谱仪器制造上海有限公司)，双道微量注射泵(浙江浙大医疗设备有限公司)，酶标仪(美国BioRad)，冷冻干燥机(美国Virtis)。

1.3 肝脏脱细胞基质的制备 参照文献[18]报道的方法对肝脏进行脱细胞处理。其制备方法简述如下：分离完好的肝脏，1% SDS灌注2h，0.01mol/L PBS溶液冲洗15min，1% Triton X-100灌注30min，0.01mol/L PBS溶液冲洗3h。将洗脱好的肝脏，冷冻干燥，分装密封，环氧乙烷消毒备用。

1.4 ECM水凝胶的制备 在无菌条件下将肝脏脱细胞基质剪碎，按照10mg/ml比例加入盐酸-胃蛋白酶溶液中，室温缓慢搅拌至溶解状态，调节pH值至7.4，然后将该溶液置于37℃，观察其成胶时间。

1.5 表面形貌表征 将冻干的ECM水凝胶样品在液氮中冷冻，然后将其淬断形成新鲜界面，界面喷金后，在扫描电镜下观察样本表面形貌结构。

1.6 细胞种植 将ECM水凝胶制备成24孔板大小，放入24孔板中，紫外灯灭菌2h后，用无菌生理盐水清洗2次；将BRL-3A 细胞以8000个/孔的密度接种于ECM水凝胶上，加入含10%胎牛血清的DMEM培养液，同时设置空白培养板作为对照组；最后将孔板置于37℃、5% CO2培养箱中进行培养，隔天更换培养液。

1.7 细胞活力检测 采用Live/Dead活性/细胞毒性试剂盒检测BRL-3A细胞在ECM水凝胶上的成活情况，以空白培养板作为对照组。在培养1d和3d时，按照试剂盒说明书加入相关试剂，染色后荧光显微镜下随机选择10个视野观察，利用Image J 软件计算水凝胶组与对照组活细胞和死亡细胞的数目，进行统计分析。细胞活力计算公式为：细胞活力=活细胞数/(活细胞数+死细胞数)×100%。

1.8 细胞增殖情况检测 采用AlamarBlue 法检测ECM水凝胶对BRL-3A细胞增殖的影响，以空白培养板作为对照组，每组设置3个复孔。在指定时间点添加AlamarBlue试剂孵育后，采用酶标仪(波长为 570nm和610nm)检测水凝胶组和对照组的吸光度(OD)值，记录数据并进行统计分析。

1.9 细胞黏附检测 培养1d后，通过细胞骨架染色观察BRL-3A细胞的黏附情况(水凝胶组)，以空白培养板作为对照组。具体方法如下：每孔用PBS清洗3次，4%多聚甲醛固定30min，PBS冲洗3次，每次5min；然后每孔加入浓度为5mg/L的FITCPhalloidin溶液，避光孵育10min；PBS洗3次，每次5min；最后加入浓度为5mg/L的DAPI溶液，避光孵育5min；PBS清洗3次，在荧光显微镜下观察细胞形态。

1.10 病理学观察 肝脏脱细胞基质经4%多聚甲醛固定、常规脱水、石蜡包埋、切片等步骤制备为石蜡切片，行HE染色，在光学显微镜下观察标本的组织形态。

1.11 统计学处理 采用SPSS 13.0软件进行统计分析。计量资料在满足正态性的基础上以±s表示。两组间比较采用独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 肝脏脱细胞基质鉴定 HE染色可见肝脏脱细胞基质呈网状结构，无蓝染胞核物质(图1A)；DNA含量测定结果显示脱细胞基质中DNA含量明显低于正常肝脏组织，差异有统计学意义(图1B，P＜0.001)，进一步证细胞已经完全被洗脱掉，获得了理想的肝脏脱细胞基质材料。

2.2 ECM水凝胶的大体观察与内部显微结构 脱细胞基质经盐酸-胃蛋白酶溶液溶解后在常温下呈现液态(图2A)，但当置于37℃ 10～15min后，凝结为固态(图2B)。扫描电镜检测显示ECM水凝胶呈现为多孔状结构，不同粗细的ECM纤维呈网状分布(图2C)。

2.3 细胞毒性研究 经Live/Dead染色试剂盒检测BRL-3A细胞在ECM水凝胶上的存活情况，由图3A可见，培养1d和3d后，与对照组比较，水凝胶组绿色荧光细胞(即活细胞)较多，红色荧光细胞(即死细胞)较少。统计结果表明，水凝胶组细胞活力略高于对照组(图3B)，提示本实验制备的肝脏ECM水凝胶有利于细胞生长。

图1 肝脏脱基质的鉴定Fig. 1 Identification of acellular matrix for liver tissue

图2 ECM水凝胶大体观察及表面形貌Fig. 2 General observation and surface characterization of ECM hydrogel

图3 细胞毒性实验结果Fig. 3 Results of cytotoxicity test

2.4 细胞增殖情况检测结果 采用AlamarBlue法评估BRL-3A细胞在ECM水凝胶上的增殖情况，结果可见，培养1d和3d后，水凝胶组细胞的吸光度值显著高于对照组(P＜0.05，图4)。

2.5 细胞黏附检测结果 通过FITC-Phalloidin染色细胞骨架(图5A)，在免疫荧光显微镜下观察BRL-3A细胞在ECM水凝胶及空白培养板上培养1d后的黏附情况，结果显示细胞在水凝胶表面呈梭形生长，细胞生长状态明显好于对照组，统计结果显示每个视野下水凝胶组黏附的细胞数量(84±8个)显著高于空白对照组(53±7个，P＜0.05)。

图4 AlamarBlue法评估BRL-3A细胞在ECM水凝胶上的增殖情况Fig. 4 Proliferation of BRL-3A cells in ECM hydrogel detected by AlamarBlue method

图5 两组细胞黏附情况Fig. 5 Cell adhesion of the two groups

3 讨 论

近年来，可注射水凝胶在再生医学领域的应用受到研究者的极大关注[4]，特别是脱细胞基质水凝胶材料，不但具备低免疫原性，含有丰富的生物活性成分，能为细胞提供更接近于天然组织的微环境，而且可微创注射于组织损伤部位，具有独特的临床应用价值[11-12]。因此，国际上掀起了基于可注射性ECM水凝胶材料研究的热潮，结果显示其在心肌、软骨和皮肤组织损伤修复中均可发挥有益的促进作用[14,16-17]。然而，目前有关肝脏ECM水凝胶的研究鲜见。因此本研究制备了肝脏ECM水凝胶，并系统评价其对肝细胞生长、黏附和增殖的影响。

脱细胞基质是运用化学、酶解或机械等方法去除组织器官中的细胞成分，而保存细胞外基质成分的一种技术[10]。本实验对大鼠肝脏进行脱细胞处理，获得肝脏脱细胞基质材料，HE染色观察可见脱细胞基质为红色网状，未见细胞残留，证实获得了理想的脱细胞基质材料，与文献报道的一致[18]。肝脏脱细胞基质经溶解后制备成水凝胶，扫描电镜观察可见其呈交错排列的网状多孔结构，表明肝脏ECM水凝胶具有细胞附着增殖的充足空间，具备成为可注射支架材料的良好条件。

生物相容性是评估组织工程支架材料的重要指标，也是支架材料临床应用的前提和基础。其中，体外细胞毒性评价是生物相容性评价的最基本指标之一。本实验采用Live/Dead染色、AlamarBlue法和细胞骨架染色对肝脏基质水凝胶的生物相容性进行了评价。Live/Dead细胞毒性检测显示，水凝胶组细胞活力略高于对照组，表明制备的肝脏ECM水凝胶有利于细胞的生长。此外，AlamarBlue法和鬼笔环肽染色检测结果分别提示ECM水凝胶促进了肝细胞的增殖和黏附能力，这与心脏组织来源制备的水凝胶相似[13]。上述结果表明ECM水凝胶材料具有良好的细胞相容性。分析可能原因如下：其一，ECM水凝胶具有亲水性的多孔网状结构，有利于细胞黏附于其表面；其二，ECM水凝胶含有细胞外基质的多种生物活性分子，可为体外生长的细胞提供与体内相似的微环境，有利于细胞的黏附和生长。本课题组后续将针对ECM水凝胶在体内的生物相容性进行深入研究。

综上所述，本研究成功制备了网状多孔结构的肝脏基质水凝胶，该水凝胶有利于肝细胞生长，并可促进肝细胞的黏附和增殖。本研究制备的肝脏基质水凝胶生物相容性良好，有望作为可注射性水凝胶材料在终末期肝病的治疗中发挥作用。

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