吴麟 何飞 李桂梅 郝虹 王佩杰，3 王干，3 陈振宇 张佳 罗伟

阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征（OSAHS）组织病理学上主要表现为上皮组织细胞增多、细胞外基质沉积、基质退化纤维化、血浆蛋白沉积于组织间隙，基本特征是细胞外基质（exreacellular matrix,ECM）过度沉积和组织结构改建。基质金属蛋白酶类（marrix metalloproteinase,MMPs）是降解ECM的最重要的蛋白酶，MMPs表达活性增强可使ECM合成与降解失衡，在机体内活化的MMPs和基质金属蛋白酶组织抑制剂 (tissue inhibitors of matrix metalloproteinase，TIMPs)之间是动态变化的平衡关系，这种平衡关系影响着和决定了MMPs的活性水平的高低。有研究认为OSAHS患者MMP-9代谢异常，血清MMP-9可反映OSAHS病情严重程度，但MMPs和TIMPs在OSAHS发病机制中的作用研究甚少，在OSAHS上气道细胞外基质重塑过程中，MMPs和TIMPs是如何发挥作用及其影响因素，此类相关研究目前有少有报道。本课题以OSAHS软腭组织为研究对象，通过免疫组化染色方法，探讨基质金属蛋白酶 -9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）和基质金属蛋白酶组织抑制剂-1(tissue inhibitors of matrix metalloproteinase 1，TIMP-1)在 OSAHS患者软腭组织中的表达及分布。

资料与方法

1 一般资料

多导睡眠监测确诊为OSAHS并经手术治疗的男性患者30例，重度10例，中度10例，轻度10例，年龄 22～48岁，平均（34±7.3）岁。多导睡眠监测结果显示：AHI为5.4～66.4次/h，最低SO2为36%～86%，平均64.5±14.0%。颈围（38.4±1.8）cm。对照组患者10例，均为单纯性慢性扁桃体患者，经多导睡眠监测排除OSAHS，年龄20～54岁，平均（32±8.1）岁。两组患者的性别、年龄无统计学差异。

2 研究方法

2.1 标本取材

OSHAS患者咽部手术中，在距软腭游离缘约1.0～1.5cm处切开粘膜，切取0.5cm×0.5cm×0.3cm组织块，包括黏膜层并深达肌层。慢性扁桃体炎患者术前知情同意，术中于扁桃体窝上极向内上稍扩大，在相应部位切取0.5cm×0.5cm0.3cm组织，包括黏膜层和肌肉层。所有标本收集完全后，同一批次同时染色以减少实验误差。

图1 一例重度OSAHS患者软腭切片MMP-9染色。可见细胞间质内、浆液腺上皮、混合腺细胞膜及细胞浆内出现深染。（DAB,100X）

图2 一例重度OSAHS患者软腭切片TIMP-1染色。可见细胞间质内、浆液腺上皮细胞内和细胞膜深染，横纹肌内出现腺泡深染。（DAB,100X）

2.2 免疫组化方法

10%甲醛固定、石蜡包埋，3μm切片，链霉素-生物素（SP）免疫组化法，TIMP-1、MMP-9单抗及 SP试剂盒（中杉金桥生物技术有限公司，北京），PBS阴性对照，DAB染色。免疫组化染色结果判定：在细胞膜或/和胞浆有棕黄色颗粒沉着判断为阳性染色。

2.3 图像采集和分析

MMP-9、TIMP-1的表达水平用累积光密度（integrated optical density，IOD）表示。Olympus BX40显微镜，相同放大倍数及曝光条件下，每张切片标本随机选取5个视野拍摄5张图片。Image-pro plus6.0图像分析软件，计算所拍图片IOD值并取其平均值。每次分析前先取阴性对照组图片进行矫正。两位病理医师独立观察和计算其均值。

3 统计学分析

SPSS 13.0软件，组间比较用单因素方差分析，Pearson相关性检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1 MMP-9、TIMP-1在软腭组织中的分布（HE染色）

MMP-9、TIMP-1广泛出现在上皮细胞及细胞间质中，染色细胞包括上皮细胞、内皮细胞浆液腺上皮、混合腺细胞，在横纹肌肌肉观察到肌肉中出现腺泡深染。在重度OSAHS患者中染色强（图1、图2）。

2 MMP-9、TIMP-1在软腭组织中的免疫组化染色结果对比

MMP-9在对照组中呈弱阳性表达，随OSAHS程度的加重，表达强度增加，重度OSAHS组中呈强阳性表达，差异具有统计学意义。TIMP-1对照组中呈弱阳性表达，随OSAHS程度的加重，表达强度增加，在重度OSAHS组中呈强阳性表达，差异具有统计学意义。

经单因素方差分析，4组MMP-9表达差异明显（F=69.39，P＜0.001），采用 LSD检验，4组间两两比较差异均有统计学意义（P＜0.01）。4组TIMP-1表达差异明显（F=43.50，P＜0.001），采用 LSD 检验，4 组中除中度组与重度组之间比较差异无统计学意义（P=0.165），其余两两比较差异均有统计学意义（P＜0.01）。见表1、图 3、图 4。

表1 4 组 MMP-9、TIMP-1 表达的比较（IOD,±s)

表1 4 组 MMP-9、TIMP-1 表达的比较（IOD,±s)

组别 n MMP-9(×104) F P对照组 10 2.51±0.86 69.39 ＜0.001轻度 OSAHS组 10 6.80±2.30中度 OSAHS组 10 12.59±3.66重度 OSAHS组 10 18.59±2.96 TIMP-1(×104)4.83±1.62 10.65±4.31 19.14±2.77 21.48±5.06 F 43.50 P＜0.001

图3 4组MMP-9表达的比较

图4 4组TIMP-1表达的比较

3 MMP-9、TIMP-1在软腭组织中的表达与AHI的相关性

以AHI为横坐标，MMP-9、TIMP-1为纵坐标绘制散点图，进行直线回归分析，40例AHI分别与MMP-9、TIMP-1表达均呈正相关，且相关性好（Pearson 相关：r=0.887，P＜0.001；r=0.741，P＜0.001）。见图5。

图5 40例AHI与MMP-9、TIMP-1表达的相关分析散点图

讨论

上气道解剖结构异常所导致的气道狭窄阻塞是OSAHS的重要病因之一。OSAHS上气道狭窄源于软组织肥厚、组织水肿、肌肉组织变性、脂肪组织浸润以及外周神经末梢退变，组织病理学上主要表现为上皮组织细胞增多、细胞外基质沉积、基质退化纤维化、血浆蛋白沉积于组织间隙，基本特征是细胞外基质（exreacellular matrix，ECM）过度沉积和组织结构改建，而ECM降解减少是导致其过度沉积的主要原因之一。Ⅳ型胶原纤维作为基底膜主要骨架，Ⅳ胶原纤维的缺乏导致基底膜变弱。

研究显示OSAHS患者夜间反复出现的氧化应激状态可导致各种炎症因子表达异常和MMPs启动，MMPs活性增强可使ECM合成与降解失衡，在心血管疾病的发病过中起重要作用，两者共同参与动脉硬化形成、心肌和血管重构及心室扩张[1-3]，改善OSAHS患者缺氧状态可降低MMPs表达和心血管疾病发生[4，5]。鉴于MMP-9在OSAHS及相关疾病中的重要性，血清MMP-9监测可以作为OSAHS疗效评判指标之一[6]。

MMP-9是MMPs家族成员之一，其作用底物广泛，MMP-9可降解多种ECM成分，包括基底膜的主要成分IV型胶原。Hoshino等[7]研究显示MMP-9、MMP-9 mRNA的表达和活性在哮喘患者的支气管肺泡灌洗液、痰、血中都增加。中耳胆脂瘤研究中，MMP-9在胆脂瘤上皮各层细胞均有表达，但基底膜染色强度明显高于外耳道皮肤，MMP-9作为胶原降解的关键酶在启动胆脂瘤基质降解中起主导作用[8]。

TIMP-1由巨噬细胞、成纤维细胞、内皮细胞、角质生成细胞、平滑肌细胞合成，广泛存在于组织和体液中，能抑制绝大多数的MMPs，可与MMP-1、MMP-9、MMP-3等形成高亲和力、非共价键复合物。TIMP-1的组织分布与MMP-9大致相同，可选择性调节MMP-9的活性。MMP-9/TIMP-1二者的平衡状态对ECM合成和降解起着重要的调节作用，是细胞外周环境的主要调节物质。

体内MMPs和TIMPs建立了基质合成和降解的平衡。Hoshino等[7]研究了两组哮喘患者，每天吸入二丙酸倍氯米松800ug组和安慰剂组，6个月后支气管镜检查显示实验组上皮下基底膜胶原沉积和黏膜下MMP-9表达下降、TIMP-1表达升高，提示激素可通过调节失衡的MMP-9/TIMP-1比值而抑制气道重塑[7]。对恶性肿瘤组织水平的MMPs和TIMPs研究显示，MMPs过度表达、MMPs和TIMPs的平衡关系破坏可导致ECM降解，促进肿瘤浸润和转移；而TIMPs过度表达可能阻止ECM降解，抑制肿瘤浸润转移[9]。

有关MMPs与OSAHS关系的研究显示，OSAHS患者呼出气冷凝液中MMP-9明显升高，与患者AHI呈正相关，与LSO2呈负相关[10]。OSAHS患者血清和呼出气冷凝液中MMP-2比正常对照组高，中重度OSAHS患者比轻度OSAHS升高更加明显[11]。血清中MMP-9水平OSAHS患者比正常对照组明显增高，MMP-9水平与患者AHI呈正相关.与睡眠呼吸障碍事件时最低Sp02呈负相关[12]。急性脑梗死合并OSAHS患者MMP-9水平更高，呼吸暂停越严重的患者血清MMP-9水平越高，颈动脉内-中膜厚度与血清MMP-9呈正相关[13]。

本研究显示MMP-9、TIMP-1广泛出现在软腭上皮细胞及细胞间质中，表达细胞包括上皮细胞、内皮细胞浆液腺上皮、混合腺细胞，在横纹肌肌肉亦观察到肌肉中出现腺泡深染。随OSAHS程度的加重，表达强度增加，在重度OSAHS组中呈强阳性表达。MMP-9在软腭的表达增强可使基底膜的降解增加，细胞外基质的过度沉积，随着OSAHS程度的加重而表达增强，机体内MMPs和TIMPs之间的动态平衡体系一旦打破就将影响ECM变化和组织结构改建。TIMP-1作为MMP-9的特异性抑制剂在维持MMP-9/TIMP-1平衡中具有重要作用，本研究显示随着OSAHS程度的加重，MMP-9的表达增强，TIMP-1的表达亦增强，二者出现共同表达增强的趋势，其机制尚未明确，是否有可能为维持更高水平的平衡，亦或是一种代偿性反应。

OSAHS发病机制尚未明了，对于MMPs和TIMPs在OSAHS上气道组织重塑中过程中的作用尚未阐明。本研究结果显示在软腭组织中，MMP-9和TIMP-1的表达随OSAHS程度的加重，表达强度增加，结合其他学者对OSAHS血液中MMPs和TIMPs研究成果，究竟是上气道局部组织病理改变而引起MMPs和TIMPs在血液中的表达异常，还是血液中的MMPs和TIMPs的表达异常而引起上气道的局部改变，其中因果辨证关系需要进一步探索，以期更深入的了解MMPs和TIMPs在OSAHS发病机制中的作用。由于本文样本量较少，今后需要进一步扩大样本研究。

1 Yan AT,Yan RT,Spinale FG,et al.Plasma matrix metalloproteinase-9 level is correlated with left ventricular volumes and ejection fraction in patients with heart failure.J Card Fail,2006,12(7):514-519.

2 牛占从，平芬.阻塞性睡眠呼吸暂停综合征患者血清基质金属蛋白酶-9水平的变化.河北医药,2005,27（3）:196-197.

3 冯晓辉，刘彬，王继华，等.基质金属蛋白酶-9与游离脂肪酸在重度OSAHS患者血清中的表达及研究.临床耳鼻咽喉头颈外科杂志,2011,25（3）：109-113.

4 王海峰.OSAHS合并冠心病患者血浆MMP-9、TIMP-1的变化.医学临床研究,2010,27（10）：1818-1820.

5 Tazaki T,Minoguchi K,Yokoe T,et al.Increased levels and activity of matrix metalloproteinase-9 in obstructive sleep apnea syndrome.AM J RES CRIT CARE,2004,170：1354-1359.

6 牛占从,平芬,李贤,等.OSAHS、OSAHAHT患者血清金属蛋白酶-9及其抑制因子水平.中国老年学杂志,2005,25（8）:874-876.

7 Hoshino M,Takahashi M,Takai Y,et al.Inhaled corticosrteroidsdecreasesubepithelial collagen deposition by modulation ofthe balance between matrix metallopro-teinase-9 and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 expression in asthma.J Allergy Clin Immunol,1999,104,356-363.

8 王辉兵,徐志文,唐安洲,等.中耳胆脂瘤基质金属蛋白酶2，9的活性检测及临床意义.临床耳鼻咽喉科杂志,2004,18(10):620-622.

9 Sier CF,Kubben FJ,Ganesh S,et a1.,Tissue levels of matrix metalloproteinases MMP 2 and MMP 9 are related to the overall survival of patients with gastric carcinoma.Br J Cancer,2008,74(3):413-417.

10 徐建,李一禄,陈济明,等.OSAHS患者呼出冷凝液中MMP-9 的 变 化.临 床 肺 科 杂 志 ,2014,19（9）:1678-1679.

11 朱建勇,曾玉琴,邝军,等.阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征患者血清和呼出气冷凝液中基质金属蛋白酶-2的水平及意义.国际呼吸杂志，2013，33(11):830-833.

12 范嘉铨,陈飞鹏,黄华兴.阻塞性呼吸暂停低通气综合征患者血清sCD40L、IL-18、IL-6及MMP-9的水平及意义.实验与检验医学,2013,31（2）：115-117.

13 赵慧新,赵会媛,闫奕,等.急性脑梗死合并阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征患者颈动脉内-中膜厚度及血清基质金属蛋白酶-9水平变化.中国全科医学,2014,18（24）:2859-2861.