张少伟 崔红艳 苏瑛

摘要：【目的】明确促卵泡激素β亚基（FSHβ）基因在雷州黑鸭群体中的遗传变异情况，为雷州黑鸭群的品种选育提供分子标记。【方法】采用PCR-SSCP对200羽雷州黑鸭FSHβ基因的外显子2（exon2）和内含子l（intl）进行多态性检测，通过测序筛查出多态性位点（SNP位点），同时分析不同基因型与雷州黑鸭产蛋性状间的相关性。【结果】在雷州黑鸭FSHβ基因的g.1103451A>T（intl）处发现一个单核苷酸突变位点（A→T），其存在3种基因型（AA型、AT型和TT型），对应的基因型频率分别为0.538、0.359和0.103。T等位基因频率（0.718）高于A等位基因频率（0.282），且g.1103451A>T位点在雷州黑鸭群体中符合Hardy-Weinberg平衡状态（P>0.05）。雷州黑鸭的开产日龄以TT型个体最早，其次是AT型个体，分别比AA型个体提前5.48和4.00 d，其差异均达显著水平（P<0.05，下同）；在开产体重和300日龄产蛋数方面，也表现为TT和AT型个体显著高于AA型个体，且以TT型个体最高，分别为1299-31g/羽和134.37枚；其他产蛋性状指标在不同基因型个体间的差异均不显著（P>0.05）。【结论】雷州黑鸭FSHβ因intl存在一个SNP位点（g.1103451A>T），其与产蛋性能间存在显著相关性，主要对早期产蛋和生长发育具有促进作用，可作为雷州黑鸭品种选育的辅助选择分子标记。

关键词：雷州黑鸭：FSHβ基因：SNP位点：产蛋性能：关联分析

0引言

【研究意义】雷州黑鸭原产于广东省雷州半岛，是经自然驯化与当地人民长期选育而形成的蛋鸭品种，通体乌黑亮泽，产蛋多，蛋个大，蛋壳青绿色，蛋黄橘红，口感鲜美，且具有耐粗饲、抗病力和觅食力强、环境适应性广等特点（汤绮明，2013；黄骏腾等，2014）。在标准的饲养条件下，母鸭开产日龄为90～120日龄，其中，春鸭在90日龄即可开产，而秋鸭需到120日龄才开始产蛋，产蛋期长达1年，年均产蛋量250枚左右，高峰期产蛋率在90%以上（黄骏腾等，2014）。可见，雷州黑鸭是培育高产、早熟、抗病型蛋用鸭的珍贵遗传素材。促卵泡素（FSH）是一种糖蛋白类促性腺激素，由动物垂体前叶嗜碱性细胞分泌（Wang and Bernard，2012；李红飞等，2017），是由a亚基和特异性β亚基形成的异源二聚体，调节下丘脑—垂体一性腺生殖轴中的反馈和负反馈作用（Huanget al，2015）。FSH的a亚基较保守，β亚基则决定种属特性，故其行使的生物功能主要依赖于β亚基的特异作用，但β亚单位只有与a亚单位结合才具有生物学活性（Kato，1988；You et al，1996）。此外，FSHβ基因与畜禽繁殖性状密切相关（杨孔等，2014；李俊等，2015；王蒙，2015；秦玉梅等，2017），因此，加強FSHβ基因研究对推进畜禽品种改良具有重要意义。【前人研究进展】目前，有关家畜FSHβ基因的研究主要集中在基因多态性与猪羊产仔数、牛产奶量等的相关性分析方面。李俊等（2015）在广西环江香猪中未能检测出FSHβ基因的多态性位点（SNP位点），表明FSHβ基因型在动物繁殖性能上具有特异性和种属性特点。Nazifi等（2015）运用PCR-SSCP对3种本地羊的FSHβ基因多态性进行分析，结果发现FSHβ基因位点在不同种群间存在明显差异。胡闪耀（2016）对美系和法系大白猪的研究发现，FSHβ基因存在AA、AB和BB基因型，其关联性分析结果表明，无论是初产大白母猪还是经产大白母猪，均以BB基因型个体的总产仔数、健仔数和初生窝重最高。Aljuaydi等（2016）研究两个不同埃及山羊品种FSHβ基因外显子1（exonl）、内含子2（int2）和外显子3（exon3）位点遗传多态性及其与窝产仔数的相关性，结果发现AA基因型在两个山羊品种中均具有更多的产仔数。姚毅等（2016）通过分析波尔山羊、成都麻羊FSHβ基因多态性与产羔数的相关性，发现FSHβ基因可能是控制山羊繁殖性能的一个主效基因。在家禽方面，FSHβ基因研究侧重于基因多态性与产蛋量（韩厚明等2008）、开产日龄（王青娟，2012）、蛋品质（王蒙，2015）等繁殖性能的相关性。洪坤月等（2007）采用PCR-SSCP检测太湖鸡的FSHβ基因多态性，结果发现FSHβ基因型频率以AA型最高、BB型最低，等位基因频率A高于B，且FSHβ基因exon3位点不存在多态性。杨孔等（2014）分析了藏鸡FSHβ基因多态性与产蛋性能的相关性，结果发现藏鸡与罗曼鸡一样，其FSHβ基因exon2和exon3均无突变位点。王蒙（2015）研究表明，在连城白鸭与白改鸭杂交群体的FSHβ基因序列上存在7个新SNPs位点，其中2个为酶切位点（c.82C>G和c.308T>G），酶切位点c.82C>G与杂交群体的鸭蛋品质显著相关，而酶切位点c.308T>G与杂交群体的产蛋量极显著相关。王亚男等（2015）研究表明，京海黄鸡FSHβ基因多态性存在AA、AB、BB、CC、CD和DD基因型，H_AB基因型个体体重显著高于BB基因型个体，CC基因型个体体重极显著高于CD基因型个体。【本研究切入点】家禽血浆中FSHB的含量受光照、饥饿和年龄等多种因素影响，进而影响家禽的产蛋性能（Lewis et al，2005；额尔敦木图等，2007），即FSHβ基因可作为家禽繁殖性状的候选基因，但至今有关水禽FSHβ基因多态性与其产蛋性能的关联研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】采用PCR-SSCP对雷州黑鸭FSHβ基因多态性进行检测，通过测序筛查出SNP位点，继而分析不同基因型与产蛋性状间的相关性，明确FSHβ亚基基因在雷州黑鸭群体中的遗传变异情况，为雷州黑鸭群的品种选育提供分子标记。

1材料与方法

1.1试验材料

供试雷州黑鸭由广东省湛江市坡头恒成种养合作社提供，共200羽，于300日龄时进行翅静脉采血（1.0 mL/羽），血样-20℃保存备用。

1.2试验方法

1.2.1基因组DNA提取与检测根据HiPure BloodDNA Mini Kit说明提取雷州黑鸭基因组DNA，以1.0%琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取效果。

1.2.2 SNP位点筛查根据GenBank已公布的鸭FSHβ基因（101794876）全长序列查找其外显子2（exon2）和内含子1（intl），采用Primer Primer 6.0设计对应的扩增引物（表1），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反应体系40.0μL：其中DNA模板1.0μL，Premix Taq DNA聚合酶20.0μL，上、下游引物各1.0μL，ddH20 17.0μL。扩增程序：94℃预变性2 min；94℃30 s，退伙30 s，72℃1 min，进行34个循环；72℃延伸2 min。以1.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物是否出现在目的条带的预期位置，然后将目的基因片段送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，通过序列比对分析筛查SNP位点。

1.2.3 PCR-SSCP分析根据筛查到的SNP位点，采用Primer Premier 6.0设计扩增引物（表2），委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反应体系10.0μL：DNA模板1.0μL，Premix Taq DNA聚合酶4.5μL，上、下游引物各1.0μL，ddH20 2.5μL。扩增程序：94℃预变性2 min；94℃30 s，58℃30 s，72℃1 min，进行34个循环；72℃延伸2 min，4℃保存备用。用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增效果。取3.0μLPCR产物，加入7.0μL变性上样缓冲液，于PCR仪上295℃变性10 min后取出冰浴5 min，防止复性。经10%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，银染显色并拍照。

1.3统计分析

统计雷州黑鸭FSHB基因PCR-SSCP分析获得的各种基因型，计算基因型频率和等位基因频率，并进行卡方适合性检验。同时采用SAS 9.2对不同基因型个体问的产蛋性状进行多重比较。

2结果与分析

2.1雷州黑鸭FSHβ基因SNP位点检测结果

由图1可看出，采用exon2和intl引物进行PCR扩增，均可获得单一、清晰的目的条带，其大小与预期结果一致。测序结果表明，雷州黑鸭FSHβ基因的g.1103451A>T（int1）处存在一个突变位点（图2）。以SSCP引物进行PCR扩增，也获得单一、清晰的目的条带（图3），且条带大小与预期结果一致，即可用于后续的多态性分析。雷州黑鸭FSHβ基因SNP位点的PCR扩增产物经SSCP分型，结果发现在117羽雷州黑鸭个体中共有3种基因带型（图4），经测序得知，分别为AA型、AT型和TT型（图5）。

2.2雷州黑鸭FSHβ基因SNP位点的等位基因频率和基因型频率

由表3可知，FSHβ基因SNP位点（g.1103451A>T）中以TT型的基因型频率最高，为0.538，AT型为0.359，AA型最低（0.103）。此外，T等位基因频率（0.718）高于A等位基因频率（0.282），说明纯合的TT型是雷州黑鸭的优势基因型。经卡方适合性检验发现，，说明g.1103451A>T位点在雷州黑鸭群体中符合Hardy-Weinberg平衡状态（P>0.05）。

2.3雷州黑鸭FSHβ基因SNP位点的遗传多态性参数

遗传特性分析结果表明，雷州黑鸭FSHβ基因SNP位点（g.1103451A>T）的期望杂合度（H）为0.405，观测杂合度（Ho）为0.359，说明该位点呈中等的遗传多态性；其有效等位基因数（Ne）为1.68，多态信息含量（PIC）为0.323（0.250

2.4雷州黑鸭V基因SNP位点与其产蛋性状的相关性

由表4可知，开产日龄以TT型个体最早，较AA型个体提前5.48 d左右，二者差异显著（P<0.05，下同）；AT型个体比AA型个体提前4.00 d开产，其差异也达显著水平。在开产体重方面，TT和AT型个体差异不显著（P>0.05，下同），但二者显著高于AA型个体。300日龄产蛋数也以TT型个体最多（134.37枚），其次是AT型个体（132.58枚），AA型个体最少（123.30枚），且TT和AT型个体显著高于AA型个体。其他产蛋性状指标在不同基因型个体间的差异均不显著。综上所述，雷州黑鸭FSHβ基因TT型效应与其产蛋性能存在显著相关性。

3讨论

由于g.1103451A>T位点碱基A→T的突变位于基因内含子上，因此不会引起編码氨基酸的改变。虽然内含子在基因转录过程中被剪切，并不参与功能蛋白合成，但其变异可通过mRNA运输、基因转录、定位及翻译等过程影响基因的转录和表达（Nottet al，2003），故推测FSH基因内含子变异对雷州黑鸭的产蛋性能也有明显影响。Haigh等（2007）研究表明，内含子参与基因的表达调控，且对于某些基因的特异表达必不可少。洪坤月等（2007）研究推测，在内含子序列中可能存在某些调控因子的结合位点。本研究结果表明，雷州黑鸭FSHβ基因intl上的碱基突变（A→T）对其产蛋量和开产日龄均有显著影响，说明FSHβ基因在产蛋和早期生长方面具有促进作用，但该突变是否是通过影响FSHβ基因表达而影响其产蛋性能尚需进一步探究。此外，SSCP分型结果表明，雷州黑鸭FSHβ基因SNP位点（g.1103451A>T）的A、T等位基因频率分别为0.282和0.718，经卡方适合性检验发现g.1103451A>T位点在雷州黑鸭群体中符合Hardy-Weinberg平衡状态，即具有稳定的遗传效应；SNP位点（g.1103451A>T）的He、PIC分别为0.405和0.323，属中度多态位点。可见，雷州黑鸭群体在g.110345 1A>T位点上具有一定的选择潜力。

本研究利用SAS 9.2对不同基因型个体与其产蛋性能的表型值进行多重比较分析，结果发现雷州黑鸭的开产日龄以TT型个体最早，其次是AT型个体，分别比AA型个体提前5.48和4.00 d，其差异均达显著水平；在开产体重和300日龄产蛋数方面，也表现为TT和AT型个体显著高于AA型个体，且以TT型个体最高，说明FSHβ基因在雷州黑鸭的产蛋性能和早期生长方面具有促进作用。涂小璐等（2008）研究表明，文昌鸡FSH～]基因5端突变位点与开产日龄和42周龄产蛋量显著相关。王青娟（2012）通过分析文昌鸡FSHβ基因（intl）SNP位点多态性与其产蛋性状的相关性，结果发现AB基因型个体在开产日龄上表现出比AA基因型个体晚2.97 d的劣势。王蒙（2015）研究发现，连城白鸭与白改鸭杂交Ft代FSHβ基因突变位点c.308T>G与120日龄产蛋量极显著相关。王亚男等（2015）对京海黄鸡FSHβ基因多态性进行研究，结果发现在外显子上的突变点对产蛋性能无影响，但对早期体重有影响。虽然本研究结果与上述相关研究结果存在不同程度的差异，但可确定FSHβ基因对家禽早期产蛋和生长发育具有促进作用，即FSHβ基因g.1103451A>T位点可作为雷州黑鸭品种选育的分子标记。

4结论

雷州黑鸭FSHβ基因intl存在一个SNP位点（g.1103451A>T），其与产蛋性能间存在显著相关性，主要对早期产蛋和生长发育具有促进作用，可作为雷州黑鸭品种选育的分子标记。