尚小红 严华兵 曹升 张尚文 谢向誉 王艳 欧昆鹏

摘要：【目的】优化葛根SCoT-PCR反应体系，筛选适用于葛根的SCoT引物，为利用SCoT分子标记进行葛根种质资源鉴定、遗传多样性分析及分子标记辅助育种提供技术支持。【方法】采用正交设计对SCoT-PCR反应体系中的DNA模板量、dNTPs浓度、Mg²⁺浓度、Taq DNA聚合酶量和引物浓度5个因素进行优化，利用最佳SCoT-PCR反应体系筛选出适用于葛根的SCoT引物，并对该体系进行验证。【结果】最佳葛根SCOT-PCR反应体系20.00 μL：DNA模板50.00 ng，dNTPs 0.25 mmol/L，Mg²⁺1.50 mmol/L，引物0.80μmol/L，Taq DNA聚合酶0.50U。利用该体系从36条SCoT引物中筛选出35条可从葛根中扩增出清晰条带的引物。使用3条引物对18个葛根材料进行PCR扩增，PCR产物表现出良好的重复性、稳定性和丰富的多态性。【结论】建立的最佳葛根SCOT-PCR反应体系和筛选获得的35条SCoT引物可适用于葛根种质资种鉴定、遗传多样性分析、相关分子标记开发等研究。

关键词：葛根；SCOOPCR；反应体系优化；引物筛选

0引言

【研究意义】葛根（Pueraria Dc.）是豆科多年生藤本植物，是我国卫生部首批批准的药食同源两用植物（杨旭东等，2014）。近年来，随着人们对药食同源食物需求量的日益增涨，葛根种质资源收集和鉴定、遗传多样性分析等相关研究已成热点，主要通过测定田间性状等形态指标进行鉴定分析（罗亚红等，2015；郝建平等，2016；谭燕群等，2016），但易受环境、主观判断等因素的影响。采用分子标记技术可有效、准确地进行种质资源鉴定分析，其中，目标起始密码子多态性标记（SCoT）是结合了RAPD标记和ISSR标记的优点，具有成本低廉、操作简单、通用性强、多态性丰富等特点（Collard and Mackill，2009；熊发前等，2009）。由于不同作物的最佳SCoT-PCR反应体系和适用引物不同，因此，优化葛根SCoT-PCR反应体系，筛选适用的引物，对葛根种质资源鉴定、遗传多样性分析及相关SCoT标记开发具有重要意义。【前人研究进展】目前，分子标记技术在葛根上的研究应用较少，陈元生和彭建宗（2010）利用正交设计优化了葛根的ISSR反应体系，其他研究者则利用RAPD、ISSR和SRAP分子标记技术对葛根进行遗传多样性分析（景戌等，2010；陈大霞等，2011；周精华等，2013；郭艳艳等，2013；魏文恺，2015；袁灿等，2017）。自SCoT标记被开发以来，先后对葡萄（张君玉等，2011）、枇杷（韩国辉等，2011a）、牡丹（侯小改等，2011）、柑橘（韩国辉等，2011b）、草莓（秦国新等，2012）、铁皮石斛（赵瑞强等，2012）、大豆（李强等，2013）、芥菜（龙治坚等，2013）、蓝莓（韩国辉等，2014）、荔枝（夏玲等，2014）、药用菊花（何仁峰等，2014）、辣椒（李宁等，2015）、梨（和世玉等，2016）、木薯（严华兵等，2016）、籽用西瓜（杨静等，2016）、南瓜（王丰丰等，2017）等作物的SCoT-PCR反应体系进行了优化，将其应用于作物的遗传多样性分析（陈大霞等，2012，2017；徐旭栋等，2013；杨辉等，2017）、目的基因差异表达（吴建明等，2010；陈明辉等，2013；贺梁琼等，2014）等研究，结果表明，不同作物的最佳SCoT-PCR反应体系和适用的引物数量均不同，且SCoT分子标记具有丰富多态性，在遗传多样性分析、相关基因表达分析等相关研究上均表现出良好的适用性。【本研究切入点】至今，尚未见有关SCoT分子标记技术应用于葛根的研究报道。【拟解决的关键问题】采用正交试验设计L₁₆（4⁵）对SCoT-PCR反应体系的DNA模板量、Mg²⁺浓度、dNTPs浓度、TaqDNA聚合酶量和引物浓度进行优化，确定葛根的最优SCoT-PCR反应体系，并利用其对SCoT引物进行筛选，以期获得适用于葛根的SCoT引物，为后期利用SCoT分子標记进行葛根种质资源鉴定、遗传多样性分析、分子标记辅助育种等提供技术支持。

1材料与方法

1.1试验材料

供试的19份葛根材料来自不同产地，具体见表1，种植于广西农业科学院里建科学研究基地和生物技术研究所育种基地。其中，19号材料（广西柳州鹿寨野生葛根）用于SCoT-PCR反应体系的优化及引物筛选，其他18份材料用于反应体系验证。DNA提取试剂盒、DL2000 DNA Marker、Ex Taq DNA聚合酶、琼脂糖、50xTAE Buffer等均购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.2试验方法

1.2.1总DNA提取采集健康葛根植株的无病虫害幼嫩叶片，参照DNA提取试剂盒说明提取其总DNA，用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测其纯度及完整性，并用紫外分光光度计检测DNA浓度和纯度。将提取的DNA浓度稀释至50 ng/gL，-40℃保存备用。

1.2.2引物合成参照Collard和Mackill（2009）的36条SCoT引物序列（表2），编号分别为SCl～SC36，均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.3正交试验设计以预扩增效果较好的引物SC27作为初选引物、19号葛根总DNA为模板，进行葛根SCoT-PCR反应体系优化。SCoT-PCR反应体系20.00 μL，其中DNA模板量、Mg²⁺浓度、dNTPs浓度、引物浓度和Taq DNA聚合酶量5个因素分别设4个水平进行正交试验L₁₆（4⁵）（表3），共16个组合，每个组合3次重复，用ddH₂0补足至20.00μL。

1.2.4 PCR扩增PCR扩增程序：94℃预变性4 min；94℃30 s，50℃1 min，72℃90 s，共进行35个循环；72℃延伸5 min，4℃保存。取6.00 μL PCR产物与1.00 μL 6xLoading Buffer混匀后，用含有GelRed核酸染色剂的1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，缓冲液为1xTAE，电压110 v。电泳结束后，以紫外凝胶成像系统成像后拍照保存。

1.2.5统计分析参照何正文等（1998）的直观分析法，根据电泳图谱中的电泳条带清晰度、数量、亮度及背景干净程度分别对16个组合进行打分，其中，最优组合（条带最多，亮度强，背景清晰，无拖带杂带）得16分，最差结合（条带少、亮度弱、杂带多）得1分。利用Excel 2013计算平均分和极差。

1.2.6引物篩选以19号葛根的总DNA为模板，SCl-SC36为引物，利用优化获得的最佳葛根SCOT-PCR反应体系进行扩增，以1.0%琼脂糖凝胶电泳进行检测，从中筛选出适用于葛根的SCoT引物。

1.2.7反应体系验证随机选取SC4、SC24和SC28引物对1～18号葛根材料进行PCR扩增，采用1.0%琼脂糖凝胶电泳进行检测，验证最佳葛根SCoT-PCR反应体系的可行性和稳定性。

2结果与分析

2.1SCoT-PCR反应体系的优化结果

由图1可知，不同组合扩增结果在条带数量、清晰度和亮度方面均存在明显差异。利用直观分析法分别对16个组合的3次重复电泳图进行打分，取平均值（表4）。R反映各因素对SCoT-PCR反应体系的影响程度，即R越大，该因素对SCoT-PCR反应体系的影响越大；而K越大，表明该水平扩增效果越好（桂腾琴等，2009；严华兵等，2016），因此，5个因素对SCOT-PCR反应体系的影响程度排序为：Taq DNA聚合酶量>DNA模板量>引物浓度>dNTPs浓度>Mg²⁺浓度，结合K确定最佳SCoT-PCR反应体系20.00μL：DNA模板50.00 ng，Mg²⁺1.50 mmol/L，dNTPs 0.25 mmol/L，引物0.80μmol/L，Taq DNA聚合酶0.50U。

2.2引物筛选结果

由图2可知，除SC25外，其他35条SCoT引物均能扩增出清晰可辨的条带。其中，SC12、SC31和SC33仅扩增出1条清晰可辨的条带，其原因可能是在19号葛根DNA模板中结合的位点较少，其他32条引物的PCR产物条带清晰、数量多，且背景干净。

2.3最佳SCoT-PCR反应体系验证结果

利用直观打分法能快速判断最佳的葛根SCOT-PCR反应体系，但易受主观因素影响试验结果的准确性（何仁峰等，2014），因此，需对建立的最佳反应体系进行客观检测与验证。本研究随机选取SC4、SC24和SC28为引物，对1～18号葛根材料进行PCR扩增，结果显示，各引物从各材料中均能扩增出清晰、多态性丰富的条带（图3、图4和图5），表明建立的最佳反应体系具有稳定性和可靠性，可应用于葛根种质资源鉴定、遗传多样性分析和分子标记辅助育种等研究。

3讨论

不同作物SCoT-PCR反应体系的主要影响因素不同。如柑橘（韩国辉等，2011b）、葡萄（张君玉等，2011）、枇杷（韩国辉等，2011a）、大豆（李强等，2013）、蓝莓（韩国辉等，2014）、荔枝（夏玲等，2014）、梨（和世玉等，2016）和木薯（严华兵等，2016）等作物均以dNTPs浓度为最主要影响因素，南瓜（王丰丰等，2017）和辣椒（李宁等，2015）以引物浓度为最主要的影响因素，籽用西瓜（杨静等，2015）、草莓（秦国新等，2012）、芥菜（龙治坚等，2013）和牡丹（侯小改等，2011）以Mg²⁺浓度的影响最大，药用菊花（何仁峰等，2014）和铁皮石斛（赵瑞强等，2012）以Taq DNA聚合酶量为最主要影响因素。本研究发现，Taq DNA聚合酶量是葛根SCoT-PCR反应体系的最主要影响因素，而Mg²⁺浓度对其影响最小。可见，不同作物因其基因组序列不同，导致SCoT-PCR反应体系的各因子影响力不同，也可能是不同研究在正交设计时设定的各因子浓度具有较大差异所造成。

不同作物适用的SCoT引物及其数量也不同。可针对特定作物，通过引物筛选，选出适用的SCoT引物。侯小改等（2011）从36条SCoT引物中筛选出24条适用于牡丹的引物；李宁等（2015）从80条引物中筛选出24条适用于辣椒的引物；杨静等（2015）从41条SCoT引物中筛选出22条适用于西瓜的引物；严华兵等（2016）从36条SCoT引物中筛选出19条适用于木薯的引物；王丰丰等（2017）从51条SCoT引物中筛选出适用于南瓜的20条引物。本研究从36条SCoT引物中筛选出35条适用于葛根的引物清晰条带，与上述前人研究结果存在差异的原因可能是不同作物的基因组序列不同，导致SCoT引物在不同作物中具有不同的结合位点，从而产生不同的扩增效果。

本研究用于最佳SCoT-PCR反应体系验证的18个葛根材料中，3、4与18号材料来自广东，其余15份材料来自于广西，随机选取SC4、SC24和SC28对其进行PCR扩增，结果显示，来自于同一省（区）的葛根材料存在不同的带型，而来自于不同省（区）的葛根材料又存在相同的带型，表明葛根材料的遗传背景丰富，但不同区域的材料可能存在引种现象，需进一步利用本研究建立的最佳SCoT-PCR反应体系及筛选的适用于葛根SCoT引物进行遗传多样性分析。

4结论

建立的最佳葛根SCoT-PCR反应体系和筛选获得的35条SCoT引物可适用于葛根种质资种鉴定、遗传多样性分析、相关分子标记开发等研究。