朱 莹，丁顺凯，林烈文，刘 松，林小聪，钟克力，戴 勇，潘 凯

（暨南大学第二临床医学院，深圳市人民医院：1临床医学研究中心，2胃肠外科，广东深圳518020）

0 引言

胃癌（gastric cancer，GC）是消化道常见的恶性肿瘤之一，由于早期症状多缺乏特异性，早期病例仅占胃癌手术病例的10%～20%，大约三分之二的患者在确诊时已经处于中晚期或已出现淋巴结、血行转移，其五年生存率仅为20%～30%［1－2］。 胃癌的发病、进展及侵袭机制涉及多种免疫、遗传、分子机制及细胞生物等因素，研究胃癌发生发展过程中的分子调控机制，寻找新的生物学靶标对胃癌的诊断、治疗、预后及开展个体化治疗等都具有重要意义。

免疫组库（immune repertoire，IR）是指在任何指定时间，某个个体的循环系统中所有功能多样性B细胞或者T细胞的多态性总和。研究［3－4］表明，肿瘤患者局部或者全身处于免疫抑制或者免疫缺陷状态，是肿瘤发挥免疫逃逸的关键因素之一。肿瘤浸润淋巴细胞（tumour⁃infiltrating lymphocytes， TIL） 作为机体局部免疫状态的标志，在肿瘤免疫中起着重要的作用，TIL与肿瘤预后的关系在多种肿瘤中都已经得到证实［5－6］。早期的研究技术可以鉴别 TIL中T细胞类型，在群体水平阐明效应、辅助及调节性T细胞与临床结果的关系。但只有极少量的数据研究了TIL种群在空间上是否局限于肿瘤微环境，并区分于循环T细胞库。近年来，采用高通量测序技术研究个体免疫细胞的多态性已成为肿瘤免疫学研究的热点［7－9］。借助于免疫组库高通量测序技术，直接对肿瘤组织中所有的 T细胞抗原受体（T⁃cell receptor，TCR）基因进行深度序列测定，可以了解肿瘤内TCR的克隆性变化，从整体上研究 TIL 的特性［10－13］。

本研究采用二代测序技术，采集胃癌患者的肿瘤组织、癌旁组织及外周血，提取DNA，经多重PCR，对TCR β链的CDR3区进行建库，采用 Illumina HiSeq 2000系统测序，分析比较胃癌患者不同类型组织TCR CDR3组库的组成特征。

1 材料和方法

1.1 一般资料 原发性胃腺癌病例来源于深圳市人民医院，收集胃癌患者经手术切除的肿瘤组织及癌旁组织，胃癌诊断经由组织病理学检查确认，同时在术前采集患者外周血。7例胃癌病例中，4例男性，3例女性，年龄 26～85 岁，平均年龄（62.4±21.9）岁。

1.2 DNA提取及PCR建库 血液及组织DNA提取采用Qiagen DNA提取试剂盒，使用Qubit fluorome⁃ter测定DNA浓度。取500 ng基因组DNA作为模板，采用特异的V区引物和J区引物，用QIAGEN Multiplex PCR Kit进行多重PCR。电泳检测并使用QIAquick Gel Extraction kit胶回收100～190 bp的多重PCR产物。PCR产物中加入End Repair Mix，进行末端修复反应，并用QIAquick PCR Purification Kit进行纯化。经过末端修复后的DNA片段在其3'端连上“A”碱基，再用 Adapter oligo mix和 DNA ligase进行接头连接，在DNA片断上接上接头（adapter）。通过PCR反应富集经过接头修饰的DNA片段，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，胶回收（QIAquick Gel Extraction kit）目的片段，完成文库构建。

1.3 文库检测及测序 使用Agilent 2100 Bioanalyzer（Agilent DNA 1000 Reagents）检测文库的插入片段范围；并使用 ABI StepOnePlus Real⁃Time PCR System（TaqMan Probe）对文库进行浓度的定量。

将检测合格的文库加入NaOH变性成单链，并稀释，加入到FlowCell内，与FlowCell上的接头杂交，然后在簇生成平台cBot上完成桥式PCR扩增。最后将制备好的FlowCell采用Illumina HiSeq 2000测序系统测序。

1.4 数据分析 原始数据经过过滤、拼接得到合并序列，用miTCR软件自动校正序列错误。比对完成后，统计TCRβ链CDR3克隆的表达及插入缺失情况，并统计CDR3序列的长度分布。

根据比对分析得到的结果，统计每一个克隆的表达情况，分别统计DNA序列、氨基酸序列、V⁃J组合的表达情况。采用方差分析评价三组样品的VJ基因取用及氨基酸取用差异。同时统计每一个样品中每个克隆的表达情况，进行样品多样性差异分析和克隆表达差异分析。

2 结果

2.1 测序数据汇总 统计肿瘤组织（TIL组）、癌旁组织（adjacent normal tissues， ADJ）、外周血（periph⁃eral blood mononuclear cell，PBMC）三组标本的测序数据产出情况，其中，ADJ获得的克隆数为（41 188±29 417）、PBMC 组的克隆数为（32 184±16 054），TIL 组则为（36 038±18 999）。可以看出，癌旁组样品的平均克隆类型最高，其次是肿瘤组，最少的是外周血（无显著差异）。

2.2 VJ基因取用差异分析 通过统计分析在每个分组里面有不少于3个样品有表达的VJ基因，采用方差分析（Aov）比较了 TIL、ADJ、PBMC三组的 VJ基因取用差异，得到了23种具有显著差异（P＜0.05）的VJ基因（表 1）。

2.3 CDR3的氨基酸（aa）差异分析 根据测序得到的CDR3区氨基酸序列，将每个样品的总克隆型（total clonotype）均一到1M总量，此外，至少有一个分组里面有3个样品有表达的克隆型才会用于检验。统计得到TIL、ADJ、PBMC3组标本的CDR3的氨基酸差异取用情况。其中41种氨基酸序列具有显著差异（P＜0.05，表 2）。

表1 三组样品间23种差异取用的VJ基因

2.4 组间差异及高表达克隆（hyper express clono⁃type，HEC）分析 每个样品中表达比例高于1%的克隆型被认为是超高表达的克隆，用方差分析及成对T检验统计分析三组样品的总克隆型（total clono⁃type）、单一克隆型（uniq clonotype）、高表达克隆、D50等数据。统计结果显示，除了外周血与肿瘤组织的香侬多态性差异显著（P＝0.029）之外，三组之间的统计值无显著差异（P＞0.05），表明胃癌患者不同组织间的TCR克隆多态性及分布频率差异不明显。

2.5 组间共有克隆（shared clonotype）分析 将每个样品的克隆型总表达量归一到1 M，其中平均表达量不小于1的克隆型视为高质量的克隆型，统计分析三组样品中共有的总克隆型（图1）及高质量克隆型（图2）。图1可见，ADJ的总克隆型种类数最高，TIL其次。与图1比较，图2中显示癌旁组的高质量的克隆型并未明显增多，表明癌旁组克隆型多数为低表达，此外，在组间共有的高质量克隆型种类上，癌旁组织与肿瘤组织（12 842）明显多于癌旁组织与外周血（1211）及肿瘤组织与外周血（1925）。

表2 三组样品间41种差异取用的氨基酸序列

图1 TIL、ADJ、PBMC中共有的总克隆型分布

图2 TIL、ADJ、PBMC中共有的高质量克隆型分布

3 讨论

胃癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一，其分子机制的研究及靶向药物的开发对于早期诊断、治疗及预后具有重要意义。肿瘤浸润淋巴细胞作为重要的抗肿瘤免疫细胞，能够直接反映肿瘤微环境中的免疫状态，并与肿瘤预后相关［5－6］。 其中，T淋巴细胞是参与特异性免疫应答的主要效应细胞，其细胞表面的抗原受体是由2条多肽链αβ或γδ通过二硫键连接而成的异二聚体，其中αβ T细胞占绝大多数。在个体发育过程中，TCR β链的V、D、J基因片段发生重排，形成具有高度多样性的可变区——互补决定区3（complementarity⁃determining region， CDR3），其序列决定了一个独特的TCR克隆型，因此可通过检验CDR3的长度或序列来判断T细胞的克隆性。

Luo等［14］分析了不同分化程度的胃肠道肿瘤患者外周血中CD4＋/CD8＋T细胞亚群的CDR3谱型，发现复杂性积分（the complexity scores，反映TCR库的多样性）与肿瘤组织分化程度显著相关。此外，研究［15］证实预后较差的胃癌患者外周血中往往能发现特异性的T细胞没有被充分的诱导或者作用被抑制。近年来，采用高通量测序技术直接针对肾癌、卵巢癌、结肠直肠癌、胰腺癌等肿瘤组织中TIL的克隆特性的研究也有报道［10－13］。 在胃癌的研究上，Jia等［16］研究了28例胃癌病例的肿瘤组织、正常粘膜及外周血中T细胞的多样性，发现CDR3的氨基酸克隆型分布在不同组织中无显著差异。Kuang等［17］则检测了19例不同阶段胃癌患者的41个组织样品，发现T细胞克隆的多样性及分布频率在胃癌发展过程中没有变化。但胃损伤及相邻组织T细胞克隆的重叠随肿瘤发生过程降低。

本研究对7例胃癌病例的肿瘤组织、癌旁组织、外周血共20个样品分别进行了TCR β链CDR3区测序，获得了一些差异性取用的VJ基因序列及氨基酸序列。而CDR3全部克隆型、单一克隆型、高表达克隆的分布在不同组织间没有显著差异。在三组样品的总克隆型及高质量克隆型的重叠情况上，癌旁组织的总克隆型种类数最高，肿瘤组织其次，推测肿瘤组织内 TIL可能受到肿瘤相关抗原（tumor⁃associated antigen，TAA）的影响，其CDR3库呈现限制性表达的特点。此外，癌旁组织的TIL克隆型多数为低表达，癌旁组织与肿瘤组织的高质量的共有克隆型明显多于外周血，提示肿瘤组织T细胞向癌旁组织渗透的可能，即这些差异克隆型可能参与了胃癌细胞的迁徙及扩散过程，其具体作用机制仍需进一步研究。

由于个体免疫系统存在庞大的复杂性及个体差异性，不同组织样品间同样存在异质性，TIL TCR克隆型的表达丰度及克隆型种类水平上的差异均可能受到影响。Jia等［16］指出，胃癌患者的TIL库及 PB⁃MC库均不代表抗肿瘤反应的总体质量，因此不能预测疾病结果，而肿瘤邻近粘膜组织TCR库的多样性指数（diversity index）则是胃癌预后的生物标志物。同样的，本研究结果显示，虽然不同类型组织样品的克隆分布特性没有显著差异，癌旁组织的总克隆型在三种组织中种类数最高，多为低表达克隆型，提示癌旁组织的T细胞可能受到肿瘤组织及循环血液的共同影响，多样性更高。为了消除个体差异及病例数的影响，仍需要进一步研究癌旁组织的TCR克隆型特征，以明确胃癌肿瘤微环境的特性，对胃癌特异性抗原的鉴定可能具有重要意义。

［1］Stadtländer CT， Waterbor JW.Molecular epidemiology， pathogenesis and prevention of gastric cancer［J］.Carcinogenesis，1999，20（12）：2195－2208.

［2］Baniak N， Senger JL， Ahmed S， et al.Gastric biomarkers： a global review［J］.World J Surg Oncol，2016，14（1）：212.

［3］Koebel CM， Vermi W， Swann JB， et al.Adaptive immunity maintains occult cancer in an equilibrium state［J］.Nature，2007，450（7171）：903－907.

［4］Lee K， Hwang H， Nam KT.Immune response and the tumor micro⁃environment： how they communicate to regulate gastric cancer［J］.Gut Liver，2014，8（2）：131－139.

［5］Gooden MJ， de Bock GH， Leffers N， et al.The prognostic influence of tumour⁃infiltrating lymphocytes in cancer： a systematic review with meta⁃analysis［J］.Br J Cancer，2011，105（1）：93－103.

［6］Pagès F.Tumor⁃associated immune parameters for personalized patient care［J］.Sci Transl Med，2013，5（214）：214fs42.

［7］Calis JJ， Rosenberg BR.Characterizing immune repertoires by high throughput sequencing： strategies and applications［J］.Trends Immunol，2014，35（12）：581－590.

［8］Friedensohn S， Khan TA， Reddy ST.Advanced Methodologies in High⁃Throughput Sequencing of Immune Repertoires［J］.Trends Biotechnol，2017，35（3）：203－214.

［9］Hou XL， Wang L， Ding YL， et al.Current status and recent advances of next generation sequencing techniques in immunological repertoire［J］.Genes Immun，2016，17（3）：153－164.

［10］Gerlinger M， Quezada SA， Peggs KS， et al.Ultra⁃deep T cell recep⁃tor sequencing reveals the complexity and intratumour heterogeneity of T cell clones in renal cell carcinomas［J］.J Pathol，2013，231（4）：424－432.

［11］Emerson RO， Sherwood AM， Rieder MJ， et al.High⁃throughput sequencing of T⁃cell receptors reveals a homogeneous repertoire of tumour⁃infiltrating lymphocytes in ovarian cancer［ J］.J Pathol，2013，231（4）：433－440.

［12］Sherwood AM， Emerson RO， Scherer D， et al.Tumor⁃infiltrating lymphocytes in colorectal tumors display a diversity of T cell receptor sequences that differ from the T cells in adjacent mucosal tissue［J］.Cancer Immunol Immunother，2013，62（9）：1453－1461.

［13］Bai X， Zhang Q， Wu S， et al.Characteristics of tumor infiltrating lymphocyte and circulating lymphocyte repertoires in pancreatic cancer by the sequencing of T cell receptors［J］.Sci Rep，2015，5：13664.

［14］Luo W， Liao WJ， Huang YT， et al.Cancer of the gastrointestinal tract results in a restricted T⁃cell repertoire dependent upon tumor differentiation［J］.Cell Immunol，2011，270（1）：47－52.

［15］Zhang XY， Chan WY， Whitney BM， et al.T cell receptor Vbeta repertoire expression reflects gastric carcinoma progression［J］.Clin Immunol，2001，101（1）：3－7.

［16］Jia Q， Zhou J， Chen G， et al.Diversity index of mucosal resident T lymphocyte repertoire predicts clinical prognosis in gastric cancer［J］.Oncoimmunology，2015，4（4）：e1001230.

［17］Kuang M， Cheng J， Zhang C， et al.A novel signature for stratifying the molecular heterogeneity of the tissue⁃infiltrating T⁃cell receptor repertoire reflects gastric cancer prognosis［J］.Sci Rep，2017，7（1）：7762.