李 庆(天津市红桥医院皮肤科，天津 300131)

银屑病是一种多基因遗传背景下免疫介导的炎症性皮肤病，其患病率约为0.1%～3%[1]。银屑病主要病理表现为表皮角化过度伴角化不全，真皮乳头层毛细血管扩张，炎性细胞浸润明显。银屑病发生是以角质形成细胞异常增殖分化和血管增生为病理基础。研究表明，成纤维细胞生长因子1(FGF-1)参与了组织器官发育、伤口愈合、肿瘤发生等过程[2]；丝裂原活化蛋白激酶-1(MAPK-1)信号通路在银屑病的发生和进展过程中发挥重要作用[3]。CD34是血管内皮细胞中的分子标志物，它可反映血管新生情况[4]。本研究收集寻常型银屑病皮损组织及正常皮肤组织，采用免疫组化法及反转录酶-聚合酶链锁反应(RT-PCR)技术测定其中的FGF-1、MAPK1、CD34蛋白及mRNA表达水平，以探讨三者在寻常银屑病中的作用机制。

1 资料与方法

1.1一般资料：收集2015年7月～2016年10月在我院皮肤科接受治疗的寻常型银屑病患者34例的病变皮损作为标本，其中男18例，女16例；年龄17～40岁，平均(31.9±4.0)岁；静止期12例，进行期22例；病程1～17年，平均(3.1±0.5)年。患者入院前未进行过系统或外用药物治疗，排除伴有系统性疾病患者。所有患者均进行银屑病皮损面积和严重程度评分(PASI)。另外选择同期在我院外科手术治疗患者的正常皮肤组织34例作为对照，其中男17例，女17例；年龄18～42岁，平均(32.4±4.1)岁。上述所选患者均知情同意。银屑病组与对照组患者的性别、年龄比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2试剂：羊抗人FGF-1多克隆抗体由深圳宝凯仑科技有限公司提供；兔抗人MAPK-1多克隆抗体由上海领成生物科技有限公司提供；即用型兔抗人CD34多克隆抗体由上海沪峰化工有限公司提供；蜡块RNA提取试剂盒由北京博迈斯科技发展有限公司提供；反转录及PCR试剂盒由深圳宝安康生物技术有限公司；免疫组化试剂盒由上海国源生物技术邮箱公司提供；磷酸盐缓冲液(PBS)、柠檬酸修复液、DAB显色液由上海经科化学科技有限公司提供；二乙基焦磷酰胺(DEPC)由上海沪峰化工有限公司提供；其他试剂均由上海经科化学科技有限公司提供。

1.3方法

1.3.1RT-PCR检测：采用蜡块RNA提取试剂盒提取总RNA，检测A260/A280值。加逆转录酶0.5 μl、引物0.5 μl、RNA 500 ng，5×RT缓冲液2 μl、,最后加无核酸水至10μl配制成10 μl逆转录反应体系，置于37℃ 15 min→98℃ 5 min进行反应。加2×Quick TaqHS Dremix 25 μl、引物1 μl、cDNA 5 μl，最后加无菌三蒸水至50 μl形成50 μl PCR反应体系，置于94℃预变性2 min→94℃变性30 s→Tm-5℃退火30 s→72℃终延伸10 min( 30个循环)。取10 μl获得的RNA和2 μl缓冲液混合，加入含有0.5 μg/ml溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶中，以Tris硼酸缓冲液为电泳缓冲液，恒压80 V，电泳1.5 h,用凝胶图像成像分析仪拍片。测量A值、A值比值(即目的基因/β-actin)。

1.3.2组织芯片制备：以熔化石蜡制作空白蜡块，制作8×7点组织阵列，用穿刺针打孔(内径1.5 mm)。把供体蜡块置于45℃烘10 min，用定位仪定位组织芯片后用穿刺针取出，并放入预备好的受体蜡块内，每例取2个组织芯片。把做好的受体蜡块组织包埋压平，冷却后置入72℃烘60 min,再把芯片置入冰箱内保存待用。

1.3.3免疫组化(SP)法测定：取备好的组织芯片连续切片(厚4 μm)，常规脱蜡，抗原修复，3%过氧化氢甲醇阻断内源性过氧化物酶，加浓度1∶150的FGF-1、1∶100的MAPK-l和CD34，4℃冰箱内过夜。二抗根据试剂盒操作说明书完成。DAB显色，苏木素复染，盐酸乙醇分化，氨水反蓝，脱水，透明，封片，镜检。以PBS代替一抗为阴性对照，以所购试剂附带的银屑病阳性组织为阳性对照。34例正常皮肤组织为正常对照。FGF-1、MAPK1、CD34表达于胞质，胞质染色呈淡黄色至棕黄色时判定为阳性。根据由两人双盲法观察切片,选取≥5个高倍视野，≥1 000个细胞，对免疫组化结果进行评估。根据阳性细胞百分比和着色强度进行评分：0分：0%；1分：≤10%；2分：11%～50%；3分：51%～75%，4分：>75%。着色强度:0分：不着色；1分：淡黄色；2分：棕黄色；3分：棕褐色。根据阳性细胞百分比得分与着色强度得分之和判断阳性强弱，阴性(-):0分；弱阳性(+):1～2分；阳性(++):3～5分;强阳性(+++):6～7分[4]。

2 结果

2.1FGF-1、MAPK1、CD34 mRNA相对表达情况：银屑病组皮损FGF-1、MAPK1、CD34 mRNA的相对表达水平明显高于对照组，差异显著有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 FGF-1、MAPK1、CD34 mRNA相对表达情况

2.2FGF-1、MAPK1、CD34蛋白阳性表达情况：在银屑病皮损和正常皮肤中均有FGF-1、MAPK1、CD34蛋白表达，表达率为100%，但正常皮肤多为弱阳性表达，而银屑病皮损阳性和强阳性表达的比例明显高于对照组，差异有显著统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 FGF-1、MAPK1、CD34蛋白阳性表达情况[例(%)]

2.3FGF-1、MAPK1、CD34蛋白阳性表达与临床特征的关系：FGF-1、MAPK1、CD34蛋白阳性表达与患者性别、年龄无明显关系，差异无统计学意义(P>0.05)，进行期、PASI评分≥2.5的患者FGF-1、MAPK1、CD34蛋白强阳性表达明显高于静止期、PASI评分<2.5的患者，差异有显著统计学意义(P<0.05)，见表3。

2.4FGF-1表达与MAPK1、CD34、 PASI评分的关系：Spearman相关性分析显示，FGF-1蛋白表达与MAPK-1蛋白、CD34蛋白呈正相关(r=0.723，0.649，P<0.05)，三者与PASI评分均呈正相关(r=0.724，0.685,0.617，P<0.05)。

表3 FGF-1、MAPK1、CD34蛋白阳性表达与临床特征的关系[例(%)]

3 讨论

银屑病的基本病理改变为角质形成细胞过度增殖和血管异常增生。大量研究证实，银屑病角质形成细胞的异常增殖、分化和凋亡是多种信号通路共同参与的一个过程[5]。在这些信号通路中，MAPK信号通路起着重要作用，它是一种丝氨酸(Ser)/苏氨酸(Thr)蛋白激酶，可把胞外刺激信号经级联反应由胞膜传入胞核，参与细胞的增殖、分化、凋亡等生理、病理过程。MAPK在人类皮肤中的表达与银屑病的发生有显著的关系。FGF-1是成纤维细胞生长因子成员之一，它广泛表达于人类多种组织，也表达于表皮角质形成细胞、血管内皮细胞等[6]。FGF-1通过结合细胞表面受体FGFR-l而使其酪氨酸残基磷酸化，同时诱发信号传导级联反应，启动MAPK信号通路的下游激动因子Raf-1[7]。当细胞表面的FGFR-1识别FGF-1时会提高胞内的钙离子和c-fos等mRNA水平,刺激原癌基因的表达，引起细胞过度增殖、分化[8]。

许多研究发现，CD34、CD31、vWF等是血管细胞内皮细胞表面的分子标志物，可用于血管新生的研究[9]。本研究以CD34来对血管新生进行评估。研究表明，银屑病皮损中存在缺氧诱导因子-α、血管内皮生长因子等的高表达，而这些分子与微血管密度密切相关。FGF-l可诱导血管内皮生长因子高表达，促进血管新生，其机制可能是通过ERKl/2和P38MAPK信号通路实现。故认为，FGF-1是经非经典分泌方式出胞，在通过细胞表明受体介导的内吞作用进入胞内，同时与胞膜上的络氨酸磷酸化位点结合而发挥信号传递作用，从而使DNA合成增加，促进细胞增殖分化，加速真皮血管的新生，这对银屑病的发生起着重要作用。

本研究结果显示，银屑病皮损中FGF-1、MAPK1、CD34 mRNA的相对表达水平及其蛋白强阳性表达率明显高于正常皮肤，差异有统计学意义(P<0.05)，FGF-1、MAPK1表达上调表明，二者可能参与了银屑病的发生，而CD34表达生则表明真皮乳头层存在血管新生；进一步研究发现，进行期、PASI评分≥2.5的患者表达水平更高，说明三者的表达水平与临床分期及严重程度有关，相关性分析则显示三者间呈正相关，且均与PASI评分呈正相关，因此对三者的检测可评估银屑病的严重程度及预后。

综上所述，银屑病皮损存在FGF-1、MAPK1、CD34表达上调，FGF-1、MAPK1可能在银屑病皮损角质形成细胞异常增殖和血管异常新生中起重要作用，且其表达水平与疾病严重程度有关，对其检测利于评估疾病的严重程度及预后。

4 参考文献

[1] 何晓华.皮敏消胶囊联合他卡西醇软膏治疗寻常型银屑病的疗效观察[J].吉林医学,2014,35(8):1593.

[2] 刘 洋，张宜澜，黄亚兰，等.人工真皮联合碱性成纤维细胞生长因子在瘢痕和皮肤深度创面整复中的临床应用[J].中华烧伤杂志，2016，32(4):102.

[3] 葛新红,秦 璟,张晓鸣,等.细胞外信号调节激酶在寻常性银屑病皮损中的表达[J].中华皮肤科杂志,2010,43(12):642.

[4] 朱小红，张熔熔.D2-40/S100、CD34/S100检测在皮肤恶性黑素瘤脉管转移诊断中的应用[J].中华皮肤科杂志，2015，48(4):216.

[5] 赵 辨.中国临床皮肤病学[M].南京：江苏科学技术出版社,2010：321.

[6] Chiou WF,Lee CH,Liao JF,et al. 8-Prenylkaempferol accelerates osteoblast maturation through bone morphogenetic protein-2/p38 pathway to activate Runx2 transcription[J].Life sciences，2011,8(7):2618.

[7] Miura S,Mitsuhashi N,Shimizu H.Fibroblast growth factor 1 expression correlates with tumor progression and poorer prognosis of hepatocellular carcinoma[J].BMC Cancer,2012,71(12):36.

[8] Wu AL,Coulter S,Liddle C.FGF1 regulates cell prolif-eration，glucose and bile acid metabolism via FGFR4-dependent and independent pathways[J].PLoS One 2011,6(3):92.

[9] 郭新宾,邓 鑫,张建宁,等.大鼠脑创伤后外周血和创伤区脑组织CD34+细胞的检测[J].郑州大学学报(医学版),2014,54(1):482.