张江萍,尹卫东,刘和*

(1.山西林业职业技术学院,山西 太原 030003;2.山西省林业厅,山西 太原 030012)

0 引言

森林是陆地上最重要的碳储存库,储存着全球陆地地上植被碳库及地下土壤碳库80%以上的碳资源[1]。森林资源的合理利用对于促进经济增长,开发新资源有着举足轻重的重要作用[2-3]。随着林业资源需求量的增加,森林资源逐年减少,合理地保护森林资源已迫在眉睫[4]。透光抚育是合理利用和保护森林资源的一种重要方法。通过抚育调整群落结构和林分密度,改善林木生长和生态环境,不仅可以达到合理保留树种,促进林下经济作物生长,而且能够保障群落结构的合理性,使其形成良好的层次结构和各种林分结构,提高物种的丰富度和增强林下栽培资源的合理利用[5-7]。

灵芝(Ganodermalucidum)是传统的扶正固本,滋补强壮的珍贵药材,具有“安神,保神”,“人心生血,助心充脉”,“益肺气,益肝气,益脾气”等功效[8-9]。在我国,灵芝作为药用已有两千多年的历史[10]。现代医学研究表明,灵芝在免疫系统的调节[11]、抗肿瘤[12]、抗病毒、清除体内自由基[13-14]、降血脂等方面具有极其重要的作用[15]。目前,已经从灵芝子实体中分离到400多种活性成分,其中包括糖类(多糖和低聚糖)、三萜类、核苷类、甾醇类、多肽、生物碱、呋喃衍生物、脂肪酸、挥发油、微量元素等[16-18]。其中多糖、三萜、甾醇等是最主要的活性成分,也是目前灵芝次生代谢产物研究的热点[19]。

随着灵芝栽培产业的不断发展,传统的灵芝栽培模式因不注重产品品质、产品结构单一、有效成分含量低等缺点而逐渐在市场中失去竞争力。开发新的灵芝栽培模式,寻找与野生灵芝品质相同的灵芝单品,提高灵芝药效成分含量是近几年人们关注的重点[20]。本研究通过不用抚育方式形成3种不同的抚育样地(即强度透光H-L、中度透光M-L和弱度透光L-L),在各样地内摆放灵芝菌袋并进行常规出菇管理,采收成熟灵芝后测定灵芝子实体主要活性成分的含量变化。以期开发新的栽培模式,提高药效含量为灵芝产品的深度开发提供数据支撑和林下真菌的栽培管理提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

灵芝由山西林业职业技术学院食用菌项目组提供,保藏于山西农业大学食用菌中心。

1.2 样地概况

研究样地设置为山西关帝山林局森林生态实验站。该地区地处吕梁山脉中段,地理位置为N37°54′26″ N,E111°31′36″E,海拔283 m,属温带大陆性季风气候,具有水热同季、湿润多雨等特点,夏季均温27.6℃,年均降水量822.6 mm。样地位于实验站海拔1 600 m处,以阔叶杨桦林为主。

1.3 样地设置与灵芝栽培管理

本研究于4月中旬(生长季前)按照采伐阔叶树的程度(分强、中、弱度)共设置9块10 m×15 m标准地(各3次重复),不同标准地间距约20 m左右;强度抚育样地(H-L)通过伐除乔木层乔木侧枝和下方所有树种,形成直径约10 m的直射透光样地;中度透光抚育样地(M-L)通过伐除上方未达到林冠层的部分亚乔木及灌木,形成直径约10 m的半透光样地;弱度抚育样地(L-L) 未进行任何伐除的直径10 m的弱度透光样地。利用网格法在每块标准地设置6个5 m×5 m的小样方,对每个小样方进行编号,于5月上旬在每个小样方内摆放50个进入出菇管理期的灵芝菌袋(菌袋原料以木屑为主,规格为18 cm×40 cm×3 cm),并覆土栽培,按照常规出菇管理方式管理出菇,于10月份收集所有成熟的灵芝子实体,去除灵芝子实体表面的灵芝孢子粉,低温冷冻干燥后,粉碎过80目筛。

1.4 灵芝有效成分含量的测定

1.4.1 灵芝子实体蛋白质含量测定

用Folin-酚蛋白定量试剂盒(Solarbio)测定蛋白质含量。制作牛血清蛋白标准曲线,计算蛋白含量。

1.4.2 灵芝子实体多糖含量测定

采用硫酸蒽酮法测定多糖含量,参照郭晓蕾等[21]并略有改进。取2 g干粉加入 90 mL水加热回流提取2 h,提取液抽滤后定容至100 mL,取10 mL加入150 mL无水乙醇,4℃放置12 h沉淀多糖,离心,弃上清,沉淀加水溶解定容至50 mL,取2 mL样品加入6 mL硫酸蒽酮溶液,水浴加热15 min,625 nm处测定吸光度值。

1.4.3 灵芝子实体总三萜化合物含量测定

称取1 g样品,加入20 mL 70%(V/V)的乙醇溶液进行超声处理(超声温度40℃;超声功率250 W;时间30 min),定容至50 mL,摇匀,过滤。吸取1 mL滤液于试管中,以70%的乙醇为参照,按照标准曲线法在560 nm处测定吸光度值,以公式1计算样品的总三萜含量(以熊果酸计)[22]。

(1)

式中:m为样品质量mg,v为吸取的滤液mL,Y为灵芝三萜的含量μg。

1.4.4 灵芝子实体麦角甾醇含量测定

参照邢增涛等[23]的方法,采用HPLC方法测定子实体中麦角甾醇含量。

1.4.5 子实体矿物质元素测定

准确称取灵芝样品2 g于石英坩埚中,用小火加热至样品不冒烟,然后大火烧至样品成灰白色,转移至550℃马福炉,灰化6 h至灰化完全为止。收集样品于试管中加入5 mL HNO3,加热溶解残渣,待溶液蒸至约1 mL时,转移至100 mL容量瓶中,用去离子水定容,摇匀,采用原子吸收分光光度计测定含量。

1.5 数据处理

采用EXCEL2013和SPSS 17软件对不同透光条件各样地的透光孔隙度、灵芝子实体中有效成分含量进行方差分析(ANOVA),数据采用平均值±标准差表示,显著性差异采用 Duncan多重比较法进行比较。

2 结果与分析

2.1 不同抚育条件下林分孔隙度的差异

不同抚育条件下,林分孔隙度差异较为明显(图1)。每年4-6月份,林冠层阔叶树叶片尚未完全展开,各样地林分孔隙度均最大;6-8月份,林冠层阔叶树枝叶量增加且叶片完全展开,强光抚育和中度抚育孔隙度的差异显著较小,弱光抚育减少不显著;8-10月份,林分孔隙度随着阔叶树枝叶量的增加开始减小,而后部分枝叶成熟,孔隙度增加。

Fig.1 Canopy openness of each plot in different tends of woods图1 不同抚育条件下林分透光孔隙度

2.2 不同抚育条件下灵芝子实体中蛋白含量变化

不同抚育条件下灵芝子实体中蛋白质含量不同(图2)。M-L和H-L条件下显著高于L-L(P<0.05),M-L和H-L条件下差异显著。M-L条件下,子实体中蛋白质含量最高,达到19.71 mg·g-1,其中M-L条件比L-L蛋白质含量高42.9%,相对H-L条件仅高5.3%。强光和弱光都不利于蛋白质的积累,可能是由于强光条件下代谢旺盛,导致蛋白质消耗增加,弱光条件下子实体合成蛋白质较少所致。

Fig.2 Protein contents in G. lucidum(mg·g-1)图2 灵芝子实体蛋白质含量(mg·g-1)

2.3 不同抚育条件下灵芝子实体中多糖含量变化

由图3可知,不同条件下灵芝子实体中有效成分多糖含量不同。在M-L条件下,多糖含量显著高于H-L和L-L(P<0.05),H-L显著高于L-L(P<0.05)。M-L条件下多糖含量为1.88%,较H-L和L-L分别高11.2%和27.9%。强光和弱光都影响子实体多糖的合成。

Fig.3 Changes of polysaccharide in different tends of woods图3 不同抚育条件下多糖含量变化

2.4 不同抚育条件下灵芝子实体中三萜含量变化

由图4可知,不同抚育条件下灵芝子实体中三萜含量变化不同。M-L条件下,三萜含量为8.53%显著高于H-L和L-L(P<0.05),较H-L和L-L分别高1.2%和20.5%。H-L显著高于L-L(P<0.05)。光照影响三萜合成通路的代谢,进而影响三萜含量,强光照条件子实体启动自身抵御光照的应激反应,造成三萜合成降低。

Fig.4 Change of triterpenoids contents in different tends of woods图4 不同抚育条件下三萜含量变化

2.5 不同抚育条件下灵芝子实体中麦角甾醇含量变化

图5给出了灵芝子实体中麦角甾醇测定的HPLC图，由图6可知，不同抚育条件对子实体中麦角甾醇含量影响较大。三种抚育条件下麦角甾醇含量差异显著(P<0.05),L-L条件下,麦角甾醇含量极显著高于M-L和H-L,M-L和H-L之间也存在极显著差异(P<0.05)。L-L条件下麦角甾醇含量为0.75 mg·g-1,较M-L和H-L高出102.7%和141.9%。弱光条件下,细胞膜的流动性较差,细胞质间信号分子之间的传递减慢,造成细胞膜中麦角甾醇含量增加。

A. Comparison products,B. G.lucidum,1. ergosterolFig.5 HPLC patterns of ergosterol in G.lucidum图5 灵芝子实体中麦角甾醇测定HPLC图

Fig.6 Ergosterol contents in G.lucidum(mg·g-1)图6 灵芝子实体麦角甾醇含量(mg·g-1)

2.6 不同抚育条件下灵芝子实体中矿物质元素变化

由表1可知,不同抚育条件下灵芝子实体中矿物质元素含量有所变化,变化幅度不同。分析的12种元素中,H-L条件下4种元素含量较高,M-L条件下5种元素含量较高。其中大量元素K、Ca、Na在不同抚育之间存在显著差异(P<0.05),K和Na元素含量变化较大。L-L条件下Na含量最高,H-L条件下K含量最高。微量元素中Cu、Fe、Sr、Zn在不同抚育条件下都存在极显著差异,H-L条件下,Fe、Sr含量较高;M-L条件下仅Cu元素含量较高;L-L条件下Pb、Zn、Cd这三种微量元素含量较高。光照强度的不同灵芝子实体对元素的吸收不同,光照可能促进了K、Fe、Sr、As等元素的吸收。

表1 不同抚育条件下矿物质元素含量变化Table 1 Change of mineral elements in different tends of woods

3 讨论

光是天然林更新中最重要的因素。光照对林下群落形态、植被的生长、森林环境的异质性等有重要的影响[24]。透光抚育是促进林业更替,保持持续发展的关键之举,同时也是减少病虫害和防止森林火灾的重要手段[25]。林下作物的有效价值是检测抚育质量的重要指标,灵芝作为代表性的药用真菌,在本实验中作为检测森林透光抚育质量的最佳材料。灵芝生长对光照极为敏感,自然条件下灵芝子实体中有效成分与光照有直接关系,合理的透光抚育对于野生灵芝的栽培和生长具有重要的作用。

从4月到10月不同月份中透光孔隙度不同,导致了林内光环境的时空异质性。本实验测定了不同抚育条件下灵芝有效成分的变化。其中M-L条件下灵芝多糖、三萜化合物和甾醇这三种有效成分的含量均最高,说明光照对灵芝子实体这三种成分的影响较大。灵芝蛋白质是除了灵芝多糖和三萜外,另一类重要的活性物质。灵芝蛋白具有独特的免疫原性,在免疫调节和抗肿瘤病等方面效果显著[26]。通过林下栽培的灵芝子实体中蛋白质含量高达19.52 mg·g-1,王红梅等[27]对不同栽培品种的灵芝蛋白质进行测定发现蛋白含量最高14.09 mg·g-1,林下栽培的灵芝子实体中蛋白含量较人工栽培的最高菌株高5.43 mg·g-1。麦角甾醇是重要的生产黄体酮、氢化可的松、VD2等的前体物质,存在于绝大多数真菌细胞膜中,据研究麦角甾醇含量与真菌生物量存在相关关系,是真菌生物量的重要标志[28]。麦角甾醇作为灵芝子实体中主要的甾醇类成分对于研究灵芝中小分子酸性成分有着重要的研究意义[29]。据测定灵芝子实体中麦角甾醇含量与其他物质相比含量较少,但与其他食药用菌相比,灵芝中麦角甾醇含量高很多。本研究中,随着抚育程度的增加,灵芝子实体中麦角甾醇含量呈下降趋势,弱度抚育条件下,麦角甾醇含量达到0.75 mg·g-1,较中度和强度抚育增加了0.4 mg·g-1。光照可能促进了麦角甾醇合成同时也促进了麦角甾醇作为前体物质合成黄体酮、氢化可的松、VD2等,致使子实体中麦角甾醇含量下降[30]。灵芝中矿物元素的含量对食疗效果及中药药效影响很大,微量元素是人体机体的重要组成成分,可维持细胞的渗透压与机体的酸碱平衡,参与体内的新陈代谢、生理、生化反应、能量转换等多个过程[31]。不同人群可以根据不同症状适当采用灵芝补充所需元素,从而调节体内微量元素的平衡、缓解症状,达到食补或药补的功效。不同抚育条件下,大量元素和微量元素的分布不同,光照促进了子实体吸收K元素,排出Na元素,同时促进了对微量元素Fe、Sr、As等的吸收,K元素可舒张血管,预防血管方面疾病,Fe具有良好的补血功能。强光抚育条件下的灵芝子实体矿物质元素分布可能更有利于人体对矿物质元素的吸收。

林下菌类作物的栽培作为一种新型栽培方式,不仅可以合理地利用林下富裕空间而且菌类作物生长与植物根系形成互惠共生关系,有利于植物生长。在合理利用森林资源的同时,应注重科学发展、科学规划,各系统同步发展,在保障森林健康持续发展前提下,充分配置森林相关系统资源,从而促进森林资源的可持续利用和菌类资源的仿野生化栽培,促进生态和谐。

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