余王琴 孔丽娅 罗玉玲 刘晓谷 郑小伟

浙江中医药大学 浙江 杭州 310053

现代医学认为支气管哮喘是由肥大细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、气道上皮细胞、T细胞等参与的炎症性疾病，以气道高反应性、气道重塑为特征[1]。目前哮喘的发病机制尚不完全清楚，相关研究表明，Treg细胞与Th17细胞的免疫应答与哮喘的发病机制关系密切[2-4]。本实验以卵清蛋白致敏法结合多因素复合法建立肾气虚哮喘模型，通过大鼠脾脏流式细胞术，准确检测出Th17细胞占整个细胞亚群的百分比及其变化情况，为探究哮喘的发病及药物作用机制提供了理论依据。

1 材料

1.1 实验动物：清洁级Wistar雄性大鼠48只，体重200～250g，实验动物中心常规饲养。

1.2 主要试剂：大鼠睾酮（T）ELISA试剂盒和大鼠甲状腺素（T4）ELISA试剂盒（杭州诚维生物科技有限公司）；卵清白蛋白（Sigma有限公司）；胎牛血清（杭州天杭生物科技股份有限公司）；RPMI 1640培养基（凯基生物有限公司）；氢氧化铝分析纯（上海凌峰化学试剂有限公司）。

1.3 实验药品：①益肾喘宁汤：主要由山药、山萸肉、熟地黄、泽泻、天浆壳、苦参、茯苓、牡丹皮、沉香片、五味子、黛蛤散、旋覆花、生黄芪等组成。将药液浓缩至2.4kg/L。②普米克令舒（吸入用布地奈德悬浮液）：2ml，1mg×5支/袋，批号：317935。

2 方法

2.1 动物分组：将48只大鼠饲养7天后随机分为正常组、哮喘组、肾气虚哮喘组（肾哮组）、中药组、西药组、中西药组（中西组）共6组，每组各8只。

2.2 造模方法：分述如下。

2.2.1 正常组：实验的第1天和第8天予以生理盐水1ml腹腔注射，第15天开始，每日给予30分钟生理盐水超声雾化吸入，日1次，共14天。

2.2.2 哮喘造模：除正常组外，其他各组大鼠采用卵清蛋白致敏法进行造模。实验方法如下：①实验第1天和第8天，用含卵清蛋白100mg，氢氧化铝干粉100mg的生理盐水混合液1ml注入腹腔内，使其致敏；②实验第15天开始，将大鼠放于大小为65cm×45cm×45cm的透明罩内，以1%的卵清蛋白雾化吸入30分钟，激发哮喘，日1次，连续激发至死亡。

2.2.3 肾气虚造模：除正常组、哮喘组外，其他各组大鼠复合肾气虚造模。具体方法：①实验第1天，每日上午于同一时间对大鼠进行惊恐刺激，用梅花针叩击大鼠背部（20次/分钟），每次15分钟；②每天下午让大鼠负重游泳，先将冰袋放入深50cm的水槽中，待水温降为16摄氏度时，分批次将尾部缠有重量为该大鼠体重10%保险丝的大鼠放入水槽中，使大鼠游泳至力竭（大鼠鼻尖没入水中10秒）。日1次，共14天。

2.3 给药处理：中药组、西药组、中西组大鼠于实验第15天给药。西药组给予普米克令舒0.02%雾化吸入，中药组给予2.0g/kg益肾喘宁汤灌胃，中西组给予中药2.0g/kg灌胃、西药普米克令舒0.02%雾化吸入。

2.4 样本采集与处理：①血清采集：各组大鼠于干预后第15天处理，腹主动脉取血（10ml/只），静置4小时后，1500rpm离心15分钟，取上层血清，置-20℃冰箱备用；②脾脏采集：将脾脏取出，PBS冲洗组织后去除筋膜和结缔组织，置-80℃冰箱备用。

2.5 指标检测：分述如下。

2.5.1 肾气虚证候相关检测：血清睾酮（T）、血清甲状腺素（T4）、血清皮质醇（COR）均使用酶联免疫法检测。

2.5.2 脾脏流式检测：①大鼠脾脏单细胞悬液制备：用含2%胎牛血清的RPMI-1640培养基冲洗研磨脾脏细胞，1000rpm/min离心10min；加3倍体积红细胞裂解液室温下孵育5～10min，1000rpm/min离心10min；弃上清液，加RPMI-1640培养液混匀，制成单细胞悬液。②流式细胞仪检测大鼠脾脏Th17细胞的表达：激活：取2×106/ml脾脏单细胞悬液，在24孔板中每孔加入1ml细胞悬液，按比例加入PMA25μg/L，放入CO2培养箱中，孵育5h；胞外染色：取106/100μl细胞悬液至流式管中，加入Th17抗体，混匀，在4℃条件下避光孵育30min，1000rpm/min离心10min；破膜：在细胞悬液中加入已备好的预热至37℃的BD CytofixTM Fixation Buffer 250ul，37℃下孵育15min，再加入-20℃的破膜剂Phosflow Perm Buffer 500ul，4℃避光孵育 20～30min；24h内上机检测。

2.6 统计学方法：使用SPSS 20.0统计软件对数据进行分析，以±s表示实验结果，采用Q检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 大鼠肾气虚证候相关性指标检测：肾气虚哮喘组大鼠的T、T4、COR含量均低于正常组（P＜0.05），结合一般情况提示肾气虚证哮喘造模成功。具体结果见表1。

表1 各组大鼠血清中T、T4、COR测定比较(±s，n=8）

表1 各组大鼠血清中T、T4、COR测定比较(±s，n=8）

注：与正常组比较，*P＜0.05；与肾哮组比较，#P＜0.05。

正常组哮喘组肾哮组中西组西药组中药组141.29±3.45 141.45±4.62 52.31±6.2*127.36±7.53#107.23±6.31#112.42±3.25#95.47±6.32 84.00±6.0 48.32±1.4*84.22±4.07#56.38±3.08#68.04±4.19#78.41±1.48 75.61±1.92 65.29±2.73*73.00±3.57#68.08±2.67#70.36±1.97#

3.2 采用流式细胞术检测大鼠脾脏Th17细胞水平变化情况：见表2。

表2 各组大鼠脾脏Th17表达情况比较（±s，n=8）

表2 各组大鼠脾脏Th17表达情况比较（±s，n=8）

注：与正常组比较，*P＜0.05；与哮喘组比较，#P＜0.05；与肾哮组比较，△P＜0.05；☆交互效应检验P＜0.05

4 讨论

益肾喘宁汤由七味都气丸加味而得，用沉香、旋复花沉降之性，纳气平喘；取黄芪补气而专固肌表[7]、升阳扶正之效；苦参、黛蛤散、天浆壳清肺化痰止咳。全方升中有降，补泻兼施，诸药合用，调和气机，有补肾、纳气、平喘之功。Th17细胞是CD4+T淋巴细胞新亚群，其分泌的细胞因子IL-17有强大的促炎作用，能够募集中性粒细胞，促进细胞释放炎性因子,从而增加气道的高反应性,促使气道炎症的发生[5]。同时，Th17还能诱导细胞活化，促进气道组织纤维化从而使气道重塑发生哮喘[6]。本研究结果显示，哮喘组及肾哮组大鼠脾脏中的Th17细胞百分比高于正常组，由此我们可以推测，Th17细胞可促进气道炎症的发生，可能与哮喘发病相关。而中药组、西药组、中西组中大鼠Th17细胞比例较模型组降低，其中中西组Th17细胞数值下调最多。由此可见益肾喘宁汤与布地奈德均能有效降低机体内Th17细胞值，从而抑制炎症细胞的增多，降低气道炎症反应，达到治疗哮喘的效果，且中西药结合干预的作用最明显。

[1]Emma S Chambers,Alexandra M Nanzer,Paul E Pfeffer,et al.Distinct endotypes of steroid-resistant asthma characterized by IL-17A(high)and IFN-γ(high)immunoph-enotypes：Potential benefits of calcitriol［J］.JournalofAllergy&ClinicalImmunology,2015，382(3)：628-637

[2]武维屏,崔红生.试论支气管哮喘从肝论治的生理病理学基础［J］.中国中医基础医学杂志,2002,8(10)：1-8.

[3]崔红生,武维屏,靳德社.哮喘的脏腑论治［J］.中医杂志,2004,45(7)：546-547.

[4]倪伟,于素霞,王宏长,等.缓解期哮喘患者肾阳虚与气道炎症关系的研究——附175例病例分析［J］.中国中医基础医学杂志,2001,7(6)：60-61.

[5]王国营.参蛤青龙汤治疗支气管哮喘68例临床观察［J］.实用中医内科杂志，2013，27(11)：17-19.

[6]黄念.加味定喘汤治疗支气管哮喘急性发作期(风寒束表痰热内阻证)的临床研究[D].武汉：湖北中医药大学，2012.

[7]陈永灿.简易名方临证备要[M].北京：人民卫生出版社，2016：513.